束缚应激加重挤压伤大鼠肠道损伤及内质网应激蛋白的表达变化

发布时间：2017-12-24 17:34

本文关键词：束缚应激加重挤压伤大鼠肠道损伤及内质网应激蛋白的表达变化　出处：《河北医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:在法医实际工作中,当事人在经受非致命性损伤的一段时间后出现多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)甚至死亡的案例时有发生,如持续捆绑或限制体位等束缚情形下发生MODS,由于损伤本身较轻微不足于造成死亡,常常由于死亡原因争议较大,导致案件久拖不决。因此,研究非致命性损伤对机体各器官形态和机能的影响,对于揭示发生死亡的确切机制具有重要意义。认真分析上述案件的背景不难发现存在一个共同的特点,即均存在明确的心理应激状况。机体发生应激反应时,蓝斑-交感-肾上腺髓质系统(Locus ceruleus-norepinephrine system,LC/NE)及下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统(Hypothalamus-pituitary-adrenal cortex system,HPA)的兴奋性增强,血中儿茶酚胺(catecholamine,CA)浓度水平快速升高,一系列功能代谢改变随之发生,起到防御代偿的作用。但过强或持续时间过长的应激却可导致多种器官功能障碍和代谢紊乱,其能力储备及防御机制被逐渐消耗,内环境严重失调、紊乱,直至出现一个或多个器官衰竭和死亡。目前能够复制精神心理应激的动物模型中较为成熟的是束缚应激模型,本室以往研究表明,束缚应激对挤压伤大鼠心、肝、肾的损伤有加重作用,能够引起MODS,提示非致命性损伤致死的过程里,心理应激造成的脏器损伤可能起一定作用。当今社会,科技发展日新月异,社会竞争日趋激烈,应激导致的人群健康问题越发严重。应激引起的肠道疾病越来越受到人们关注。肠道屏障由肠上皮细胞及其细胞间的紧密连接组成,是具有多种功能的复合体。应激状态下肠道发生损伤或功能障碍,则会发生细菌移位和内毒素血症,甚至引起全身炎症反应综合征。研究表明,束缚应激可以损伤肠道屏障,可能引发慢性结肠炎症,其机制可能有多种因素比如免疫失调、微生物环境的改变等,提示肠道对心理应激极其敏感,但具体机制尚不清楚。内质网的主要功能为合成、加工蛋白质以及贮存Ca~(2+)。应激激素、细胞因子及氧自由基对内质网功能都有干扰作用,形成大量的未/错误折叠蛋白,葡萄糖调节蛋白78(glucose regulating protein 78,GRP78)、磷酸化真核细胞翻译起始因子2α(Phosphorylated Eukaryotic translation initiation factory 2α,P-e IF2α)及CHOP等内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)蛋白表达增加,ERS过程被激活。在细胞的防御适应反应过程里,ERS虽是其中的重要部分,但ERS强度过高或持续时间过长时则可诱导细胞凋亡和炎症反应造成细胞和组织损伤。目前的研究表明,ERS参与了炎症性肠病的发生发展,那么在应激造成肠道损伤过程中,ERS标志蛋白GRP78、P-e IF2α及CHOP的表达状态如何,目前国内外未见文献报道。综上,本实验为了模拟实际案件中非致命性损伤和心理应激共同参与的情况,建立了挤压伤和束缚应激的复合模型,探讨损伤和应激共同作用下大鼠肠组织的病理学改变及内质网应激蛋白GRP78、P-e IF2α及CHOP的表达变化,尝试初步探讨非致命损伤与心理应激同时作用导致死亡的机制。方法:1健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,体重220~240g,于控制条件下适应性喂养一周后,随机分为四组(每组6只)。(1)对照组(Con):大鼠于固定时间禁食水(每日8h或10h交替进行)。(2)束缚应激组(Rs):大鼠于固定时间放入束缚应激模具内进行束缚,同时禁食水(每日8h或10h交替进行)。(3)挤压伤组(CI):大鼠用无水乙醚麻醉后,于双后肢上压24kg重物,连续挤压6小时,此后不再进行挤压,每日相应时间禁食水。(4)复合模型组(Com):大鼠连续挤压6小时,于当日晚开始进行束缚(每日8h或10h交替进行)。通过记录体重、行为学改变,以评估是否成功建立束缚应激模型。通过观察大鼠挤压后局部表现、活动状态等证明挤压伤模型是否建立成功。造模7天后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主动脉取血、离心、取上清,用于检测儿茶酚胺浓度。于冰上迅速取出肠道组织(回肠)放入4%的多聚甲醛溶液中固定。制作石蜡切片,进行HE染色观察组织病理学改变,同时应用免疫组织化学染色(IHC)方法观察ERS相关蛋白GRP78、CHOP、P-e IF2α蛋白表达的变化。2数据以“均数±标准差(Mean±SD)”表示,用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),用最小显著差法(least significant difference,LSD)或Tamhane’s(t2)作两两比较,以P0.05为有显著统计学差异。结果:1大鼠体重测量结果对照组大鼠体重逐渐增重,与对照组相比较束缚应激组大鼠体重增长速度缓慢较明显,P0.01。表明束缚应激大鼠模型的建立已成功。2大鼠血浆中NE、E的浓度动态变化的检测挤压伤组大鼠血浆中NE、E浓度与对照组相比无统计学意义。与挤压伤组相比,束缚应激组和复合模型组大鼠血浆中NE、E浓度均呈现明显升高,P0.01。3 HE染色结果常规组织病理学观察结果显示,正常对照组回肠组织结构清晰,黏膜排列整齐,未见炎症水肿及其他病理学改变;束缚应激组回肠黏膜上皮细胞轻度水肿,局部可见散在小灶性炎细胞浸润;挤压伤组黏膜上皮细胞轻度水肿,黏膜组织内炎细胞浸润较明显,局部可见黏膜上皮细胞增生;复合模型组组织病理学变化最明显,可见黏膜内及黏膜间质多量炎细胞浸润,部分区域黏膜上皮细胞增生明显,局部淋巴滤泡增生明显。4 GRP78、P-e IF2α及CHOP蛋白免疫组织化学检测结果免疫组化染色结果显示,三种蛋白的表达变化趋势一致。正常对照组回肠黏膜上皮细胞的胞浆内可见弱阳性表达;束缚应激组和挤压伤组与正常对照组相比,黏膜上皮细胞胞浆内阳性表达均呈增高趋势;与挤压伤组相比,复合模型组阳性表达明显增高。结论:本实验成功建立了大鼠挤压伤和束缚应激的复合模型,通过观察肠道组织病理学改变、检测血浆中CA浓度以及肠组织GRP78、P-e IF2α、CHOP蛋白的表达变化,证实了束缚应激可加重挤压伤大鼠肠道组织损伤,ERS参与这一损伤过程。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：D919

【参考文献】