法医学尸体组织中管家基因的稳定性研究及影响因素分析

发布时间：2017-03-30 12:25

  本文关键词：法医学尸体组织中管家基因的稳定性研究及影响因素分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的 在进行基因表达研究之前，数据的标准化策略显得尤为重要。理想的内参基因应该容易检测并且在细胞周期中保持稳定表达。在不同死后经过时间里获取的法医学尸体组织对内参基因的稳定性提出了更高的要求。为了判断通常使用的人体内参照基因（管家基因）在不同的死后间隔时间内的稳定性，本课题组在前期动物实验研究基础上，以法医学尸体组织中管家基因表达的稳定性为主要研究目标，收集不同死后间隔时间的尸体检材（脑皮质、脾组织、胸大肌），并延长观察时间，使用实时定量RT-PCR技术检测六种常用的管家基因HMBS、TFRC、B2M、GAPDH、HPRT1和OAZ1的Ct值，力求探究法医学尸体组织中管家基因的稳定性与完整性；并对rRNA各亚基（5s、5.8s、18s、28s）、非管家基因（HIF1A、TNF-a）进行相对定量，试图解决分子标记物的选择对RNA定量的影响；在此基础上还初步研究了年龄对管家基因稳定性的影响。 材料方法 研究对象：分别提取6例不同死后间隔时间的尸体上的三种组织（脑皮质、脾组织和胸大肌），并根据年龄段分为婴幼儿组（0-3岁）和成人组（15-60岁），每组3例。尸检即刻分别于大脑皮质、脾组织、左侧胸大肌处取1cm3大小组织块（50mg），经100mMCaCl2和PBS缓冲液清洗、RNAlater稳定液处理后转入-80度低温冰箱保存备用。另取适量（5g）组织放入装有PBS缓冲液的广口瓶并离体放置于人工气候箱中（比照生前环境温、湿度设定），依次按不同时间点（48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h、240h）取样，并分装于RNAlater稳定液中低温冻存。 试验方法：组织提取RNA；RNA反转录为cDNA第一链；分别设计引物，通过实时荧光定量PCR检测6例尸体脑皮质、胸大肌、脾组织中不同时间点的六种常用的管家基因HMBS、TFRC、B2M、GAPDH、HPRT1和OAZ1的Ct值及rRNA各亚基（5s、5.8s、18s、28s）与非管家基因（HIF1A、TNF-a）的Ct值。 统计学处理：实验所得数据采用均数±标准差表示，多样本均数比较采用方差分析，各组数据用SPSS13.0软件进行t检验。 研究结果 1.6种管家基因在直到死后间隔时间第10天时，，仍可以被检出。其中大脑皮质中，除管家基因OAZ1各时间点Ct值差别无统计学意义，其余5种管家基因HMBS在PMI=10天时Ct值开始显著增高，TFRC、B2M、GAPDH、HPRT1在PMI=9天时Ct值开始显著增高；脾组织中，6种管家基因除B2M在PMI=10天时Ct值开始显著增高，其余管家基因HMBS、TFRC、GAPDH、HPRT1、OAZ1在PMI=9天时Ct值即开始显著增高；而胸大肌内6种管家基因各时间点Ct值差别均无统计学意义，且Ct值上下波动无规律性。 2.作为对照的2种非管家基因HIF1（低氧诱导因子，Hypoxia inducible factor1）、TNFα（肿瘤坏死因子α，Tumor necrosis factor α）尽管直到死后间隔时间第10天时仍可以被检出，但其表达则无明显的规律性可言，其中大脑皮质中，TNFα和成人组HIF1A各时间点Ct值差别无统计学意义，婴幼儿组HIF1A直到PMI=9天时Ct值显著增高；脾组织中，TNFα各时间点Ct值差别无统计学意义，HIF1A直到PMI=9天时Ct值显著增高；胸大肌内，TNFα和HIF1A各时间点Ct值差别无统计学意义，且Ct值上下波动无规律性。 3.4种rRNA亚基在直到死后间隔时间第10天时，仍可以被检出。其中大脑皮质中，4种rRNA亚基在PMI=10天时Ct值开始显著增高；脾组织中，18s rRNA各时间点与第1时间点相比，Ct值差别无统计学意义；但18s rRNA的Ct值先降低后增高，PMI=4天时是折点低值，因此PMI=9天、PMI=10天与PMI=4天相比，Ct值显著增高，差别有统计学意义；5s rRNA在PMI=10天时Ct值开始显著增高，5.8s、28s在PMI=9天时Ct值即开始显著增高；而胸大肌内，5s、5.8s、28s各时间点Ct值差别均无统计学意义，且Ct值上下波动无规律性；18s rRNA的Ct值在PMI=2天时显著降低，之后各时间点之间相比，Ct值差别无统计学意义。 4.婴幼儿组与成人组相比，管家基因的表达存在明显差异，但年龄差异与死后经过时间无交互作用。成人组内年龄差异是否会影响PMI推断尚需验证。 5.脑皮质、脾组织中管家基因的稳定性可保持死后经过时间9天以上，胸大肌中管家基因死后10天内仍然保持稳定，但管家基因表达波动无规律，无明显时间相关性。 研究结论 1.法医学尸体组织中管家基因的稳定性较好，可在PMI9-10天内保持稳定，其稳定性足以应用于推断晚期死后经过时间的研究。管家基因的组织差异性明显，脑皮质、脾组织更适于推断死后经过时间。不同管家基因之间也存在一定的表达差异，应该进一步筛选稳定性好的管家基因。非管家基因的波动性较强，不适于推断死后经过时间。 2.法医学尸体组织中rRNA各类亚基的稳定性与管家基因类似，除18srRNA表达波动性较强外，其余rRNA亚基（5s、5.8s、28s）可以作为内参基因用于死后经过时间推断，其表达规律性尚需进一步验证。 3.婴幼儿组织中管家基因的表达与成人相比有明显统计学差异，在今后研究中应加以注意。
【关键词】：法医病理学 管家基因 rRNA亚基 实时荧光定量RT-PCR 法医学尸体组织
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：D919
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 材料与方法12-16
• 结果16-52
• 讨论52-56
• 结论56-57
• 参考文献57-60
• 附表 1 研究案例的个体信息60-61
• 综述61-67
• 参考文献65-67
• 个人简介67-68
• 致谢68

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