对骨骼、牙齿DNA提取方法的深入研究

发布时间：2017-04-18 20:23

  本文关键词：对骨骼、牙齿DNA提取方法的深入研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本课题旨在对法医检案中骨骼和牙齿这两种特殊检材进行DNA检测,通过对不同脱钙剂、消化液的深入研究,采用SPSS软件分析比较不同提取方法的骨骼DNA浓度值,寻找最合适的脱钙剂和消化液,建立一套程序相对简单、结果准确、清晰可靠,DNA提取效率高的提取方法。方法:1用不同的酸类脱钙液(自制10%盐酸脱钙液、10%硝酸脱钙液、硝酸和甲酸混合脱钙液、甲酸脱钙液、HAS改良脱钙液)对骨粉采用常规方法(脱钙,消化、纯化、扩增、3130XL遗传分析仪等的一系列过程)进行DNA分型图谱分析;2用不同浓度的EDTA脱钙液(0.25mol/L、0.5mol/L、1mol/L)对骨粉进行脱钙,每组脱钙时间严格按编号从小到大采用3h、6h、12h、24h分别进行。各组脱钙完毕后均采用同种方法消化、纯化、DNA浓度测定、扩增、3130XL遗传分析仪进行DNA分型图谱分析,寻求最合适的EDTA脱钙液浓度和作用时间;3用三种不同种类的消化液(CTAB、Bone incubation buffer、QIAamp DNA Investigator)对骨粉进行消化,纯化、DNA浓度测定及SPSS软件统计分析、扩增、3130XL遗传分析仪进行DNA图谱分析,找到最合适的消化液;4用三种不同的消化液(CTAB、Bone incubation buffer、QIAamp DNA Investigator)对牙齿消化,纯化、扩增、3130XL遗传分析仪进行DNA图谱分析,目的是为了证明同样的硬组织采用上述方法进行提取,同时对上述方法予以验证。结果:1通过严格配制的酸性溶液虽然对组织及细胞均有很强的脱钙作用,但是也对DNA具有很强破坏作用,因此得到的DNA量也相对很少甚至破坏彻底,根本得不到完整的DNA分型。2在3h-24h时间段内,骨骼DNA经三种不同浓度的EDTA脱钙液脱钙后浓度值呈现的趋势不同,0.25mol/L实验组呈大致增高趋势,且在12-24h浓度均值达到顶峰,16个STR基因座全部检出率为62.5%;0.5mol/L实验组呈先升高再降低的趋势,在6-12h浓度均值最高,16个STR基因座全部检出率为90%;1mol/L实验组呈降低趋势,在3-6h浓度均值最高,16个STR基因座全部检出率为67.5%。而当比较脱钙时间一致而EDTA脱钙液浓度不同时,0.5mol/L实验组在不同的时间段上所得到的DNA浓度值仍然均高于其他两组。3一克骨粉经不同消化方法(Bone incubation buffer法、DNA Investigator Kit法和CTAB法)得到的DNA量分别为26.53±5.47ng/μL、23.63±4.56ng/μL、14.93±3.88ng/μL,经统计学中单因素方差分析表明三组数据之间的差异性具有统计学意义。同时PCR扩增后电泳检测结果显示Bone incubation buffer法和DNA Investigator Kit法基因座检出率和RFU值大致相同,均优于CTAB法。4采用与骨骼一致的CTAB、Bone incubation buffer、DNA Investigator kit三种提取方法对牙齿进行DNA检验,同样印证了上述实验方法得到结果的准确性,即CTAB法得到的DNA量较少,峰值较低,个别分型有缺如位点,与其他两种方法差异明显。结论:1在医学实验中常用盐酸、硝酸、甲酸、水杨酸、乙酸等酸脱钙剂对骨组织脱钙后进行病理涂片等效果明显,但用其对骨骼样本脱钙后进行PCR复合扩增,未得到理想分型结果,表明此类脱钙剂目前已不适合法医物证领域骨骼、牙齿DNA的提取。2在3-24小时时间段内,骨骼样本经三种不同浓度的EDTA脱钙液脱钙后DNA浓度值形成不同的趋势,0.25mol/L EDTA脱钙液组呈现出上升趋势,0.5mol/L EDTA脱钙液组呈现出先上升再下降的趋势,1mol/L EDTA脱钙液组呈现出下降趋势,其中0.5mol/L EDTA脱钙液作用6-12小时DNA浓度值可形成最高峰,说明选择浓度适中的脱钙液至关重要,浓度太低或太高都对DNA的提取不利,因此在检案中把脱钙时间控制在6-12小时之间为最佳。3采用CTAB、Bone incubation buffer、DNA Investigator kit三种提取方法得到的骨骼DNA浓度经SPSS软件统计分析,结果表明三种方法之间的差异性存在统计学意义,CTAB法得到的DNA量较少,与其他两种方法差异甚是明显,其他两组尽管在统计学意义上存在差异,但DNA扩增出来的效果差别并不大。4在法医实际检案过程中,对于硬组织骨骼、牙齿DNA的提取均可把Bone incubation buffer法和DNA Investigator Kit法作为优选方案,经实验验证两种试剂盒得到的DNA分型图谱及峰值差别不是很明显,得到的STR分型均完整性较高。
【关键词】：法医物证学 骨骼 牙齿 DNA提取方法 比较
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：D919.2
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分 不同脱钙液对骨骼DNA提取效率的影响14-22
• 1 材料14-16
• 2 方法16-18
• 3 结果18-20
• 4 讨论20-21
• 5 小结21-22
• 第二部分EDTA脱钙液浓度和时间对骨骼DNA提取效率的影响22-30
• 1 材料22-23
• 2 方法23-25
• 3 结果25-28
• 4 讨论28-29
• 5 小结29-30
• 第三部分 不同消化液对骨骼DNA提取效率的影响30-40
• 1 材料30-31
• 2 方法31-32
• 3 结果32-38
• 4 讨论38
• 5 小结38-40
• 第四部分 不同消化液对牙齿DNA提取效率的影响40-46
• 1 材料40
• 2 方法40-42
• 3 结果42-44
• 4 讨论44-45
• 5 小结45-46
• 第五部分46-49
• 真实案例分析（一）46-47
• 真实案例分析（二）47-49
• 参考文献49-51
• 综述51-59
• 参考文献57-59
• 致谢59-60
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果60-61
• 个人简历61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 叶健;季安全;郑秀芬;姜成涛;赵鑫;张纯斌;胡兰;;陈旧性骨骼DNA提取技术的研究[J];中国法医学杂志;2001年S1期

2 王静,刘雅诚,马万山,霍振义,严江伟,唐晖;骨骼DNA分析的应用研究[J];中国法医学杂志;2003年01期

3 陈爱萍;刘峰;尹路;;使用PrepFiler试剂盒提取牙齿检材DNA[J];法医学杂志;2012年01期

  本文关键词：对骨骼、牙齿DNA提取方法的深入研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：315692