基于焦磷酸测序技术利用线粒体12S rRNA基因进行种属鉴别的研究

发布时间：2017-05-02 14:08

  本文关键词：基于焦磷酸测序技术利用线粒体12S rRNA基因进行种属鉴别的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的本课题的研究目的是筛选37种物种线粒体(mtDNA)序列中的种属特异性位点,应用焦磷酸测序技术建立简便易行的大鼠,鹅,猪,黄牛,山羊,鸡,鸭,狗,小鼠,猫,鸽,人,马,兔,驴,甲鱼和鹿这17种常见动物的法医学种属鉴别体系并进行法医学应用研究。方法根据NCBI数据库查到的上述37个物种线粒体序列,利用Dna SP v5.10.1软件筛选DNA中核酸差异大的目标区域,分别命名为12S-1,12S-2,16S-1。针对3个目标区域,使用Primer Premier 5.0软件设计PCR扩增引物分别进行目标区域扩增。通过优化选择目标区域12S-2,使用PyroMarker Assay Design 2.0软件设计测序引物,利用PyroMarker Q96仪器进行大鼠,鹅,猪,黄牛,山羊,鸡,鸭,狗,小鼠,猫,鸽,人,马,兔,驴,甲鱼和鹿这17种PCR产物(片段大小约100 bp)测序,建立基于焦磷酸测序技术的种属鉴定反应体系,并抽取部分种属样本进行Sanger测序验证及灵敏度等法医学验证研究。结果(1)建立了基于焦磷酸测序技术检测12S rRNA基因进行种属鉴定体系。焦磷酸测序分析结果显示该方法仅需要12个碱基数就可以快速准确地区分。(2)本方法能够准确分型的最低DNA模板量为250pg;对煮熟肉类、陈旧血痕和未知种属来源的样本均能有效鉴别。结论本研究建立的基于焦磷酸测序技术分析12S rRNA基因的鉴别体系,可以成功鉴别大鼠,鹅,猪,黄牛,山羊,鸡,鸭,狗,小鼠,猫,鸽,人,马,兔,驴,甲鱼和鹿这17个物种。本方法具备良好的准确性和稳定性,灵敏度达到250pg,对特殊样本和未知来源的检材都可成功鉴别。本方法操作简单、快捷、成本低,能够满足法医学种属鉴定的要求。
【关键词】：法医遗传学 线粒体DNA 12S rRNA 种属鉴别 焦磷酸测序
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：D919
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-12
• 第一部分 目标基因的选择12-33
• 1 材料与方法12-17
• 1.1 基因选择12-14
• 1.2 引物设计14-16
• 1.3 引物有效性验证16
• 1.4 构建系统发生树16-17
• 2 结果17-29
• 2.1 种属间mtDNA序列多态性分析17-21
• 2.2 引物有效性验证21-26
• 2.3 三个目的片段构建进化树26-29
• 3 讨论29-31
• 3.1 mtDNA目的基因和目标区域的筛选29-30
• 3.2 引物设计30-31
• 3.3 进化树构建31
• 4 结论31-33
• 第二部分 种属鉴别方法的建立33-62
• 1 材料与方法33-42
• 1.1 样本来源及处理33
• 1.2 实验试剂与仪器33-35
• 1.3 方法与步骤35-42
• 2 结果42-56
• 2.1 PCR扩增优化结果42-44
• 2.2 焦磷酸测序用于种属鉴定44-56
• 3 讨论56-61
• 3.1 PCR扩增条件的优化56-58
• 3.2 焦磷酸测序的方法用于种属鉴定58-61
• 4 结论61-62
• 第三部分 焦磷酸鉴别体系在法医学种属鉴别的应用研究62-73
• 1 材料与方法62-67
• 1.1 样本来源及处理62
• 1.2 实验试剂及仪器62-64
• 1.3 方法与步骤64-67
• 2 结果67-70
• 2.1 未知样本的检测67
• 2.2 煮熟肉类样本的检测67
• 2.3 陈旧血痕样本的检测67
• 2.4 混合样本的实验67-70
• 3 讨论70-72
• 3.1 未知样本的检测70
• 3.2 煮熟肉类和混合样本的检测70-71
• 3.3 陈旧样本的检测71
• 3.4 焦磷酸测序的优势71-72
• 4 结论72-73
• 结语73-75
• 1 研究成果73
• 2 研究创新性73-74
• 3 研究展望74-75
• 参考文献75-80
• 综述80-87
• 参考文献84-87
• 攻读硕士学位期间发表论文87-88
• 致谢88-90

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