不同时程吗啡依赖及急性吗啡中毒对大鼠大脑皮层及海马CA1区神经细胞的影响

发布时间：2017-05-03 23:04

  本文关键词：不同时程吗啡依赖及急性吗啡中毒对大鼠大脑皮层及海马CA1区神经细胞的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:吗啡具有很强的镇痛作用,但同时又具有很高的成瘾性。近年来吗啡的滥用呈增高趋势,严重危害了人类身心健康,社会安定和谐。临床上,恶性肿瘤重度疼痛患者的吗啡使用量往往超过常规剂量,用药不规范可造成严重的后果。吗啡依赖是指以失去控制能力、强迫性连续用药为特征的慢性复发性脑疾病。急性吗啡中毒是临床上较常见的危急症,中毒后主要表现为昏迷、呼吸深度抑制,严重缺氧时可导致休克、循环衰竭,甚至死亡[1]。我室前期研究表明不同时程吗啡依赖可导致大脑局部神经细胞的变性、坏死,但引发变性、坏死的机制有待进一步深入研究。有研究报道ERS(endoplasmic reticulum stress,ERS)可能参与了吗啡导致的神经损伤,ERS相关蛋白:糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、磷酸化的真核细胞翻译起始因子2α(Phosphorylated eukaryotic translation initiation factory 2α,p-p-eIF2α)、激活作用转录因子6(artificial transcription factor 6,ATF6)、CHOP是启动ERS通路中的重要调节蛋白,它们在不同时程吗啡依赖及急性吗啡中毒中的表达状态,目前国内外未见详细报道。因此,本研究目的之一是探明不同时程吗啡依赖及急性吗啡中毒中以上ERS相关蛋白的表达变化,为吗啡导致的神经调节紊乱及损伤机制的研究提供病理形态学依据。迄今为止的研究表明,吗啡能够引起大脑出现急、慢性缺血缺氧,进而引起神经纤维及神经细胞发生多种病理学改变,引发明显的神经损伤。以往研究还表明脑损伤能够刺激内源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的增殖并能使新生的神经细胞向损伤区分化迁移,这对神经损伤的修复具有重要意义,但吗啡依赖导致的神经损伤后,内源性NSCs的增殖及分化状态目前国内外未见详细报道。因此,本研究的目的之二是采用增殖细胞核抗原Ki67及新生神经细胞特异性标记物Nurr1,分别观察不同时程吗啡依赖导致大脑神经损伤中内源性NSCs的增殖及新生神经细胞的表达状态,试图为吗啡导致神经损伤的病理状态提供科学依据。方法:1本实验采用健康雄性Wistar大鼠,体重为(300±20)g,64只,分为吗啡依赖1周对照组、吗啡依赖1周组、吗啡依赖3周对照组、吗啡依赖3周组、吗啡依赖6周对照组、吗啡依赖6周组、急性吗啡中毒对照组和急性吗啡中毒组。吗啡依赖3组大鼠按逐日递增原则,背部皮下注射盐酸吗啡,每天二次(8:00,20:00),连续5天。剂量分别为10mg·kg-1,20mg·kg-1,30mg·kg-1,40mg·kg-1,50mg·kg-1。每次注射前均用75%酒精严格消毒,一次性注射器注射。5天后确认吗啡依赖形成后,吗啡依赖1周组、3周组、6周组分别给予30mg·kg-1盐酸吗啡背部皮下注射,一天两次(8:00,20:00),分别连续注射至1周、3周、6周,建立三个不同时段的吗啡依赖大鼠模型。对照组分别注射等剂量的生理盐水。急性吗啡中毒组采用未建立吗啡依赖模型的健康大鼠一次性注射30mg·kg-1盐酸吗啡一次,急性对照组注射等剂量生理盐水,两小时后处死。模型建立后,脑组织经固定、脱水、透明、包埋、连续切片等处理后待做各种染色使用。1)苏木精-伊红(HE)染色观察常规病理学改变。2)硫堇特殊染色观察神经细胞尼氏体变化。3)免疫组织化学染色及免疫荧光染色观察相关蛋白表达变化。2统计学分析:数据以“均数±标准差(Mean±SD)”表示,用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),用最小显著差法(least significant difference,LSD)作两两比较,以P0.05为有显著统计学差异。结果:1 HE染色结果对照组大脑皮层及海马CA1区可见脑组织结构清晰,神经细胞排列整齐;吗啡依赖1周组未见明显改变;吗啡依赖3周组可见少量神经细胞固缩,神经细胞水肿,小胶质细胞增生;吗啡依赖6周组可见组织结疏松,神经细胞水肿,部分神经细胞固缩,小胶质细胞增生明显;急性吗啡中毒组见部分细胞固缩。2硫堇染色结果对照组大脑皮层和海马CA1区可见神经细胞胞浆内尼氏体清晰可见;吗啡依赖1周组未见明显改变;吗啡依赖3周组尼氏体数目减少,结构不清;吗啡依赖6周组尼氏体消失,细胞固缩;急性吗啡中毒组出现细胞固缩。3免疫组织化学染色3.1 GRP78免疫组织化学染色结果与对照组相比,吗啡依赖1周组与3周组大鼠大脑皮层GRP78阳性细胞数目逐渐增多;随着吗啡作用时间的进一步延长,在吗啡依赖6周组阳性细胞数目减少;急性吗啡中毒组阳性表达较正常组略有升高。吗啡依赖各组及急性吗啡中毒组中大鼠海马CA1区GRP78阳性细胞表达均比对照组明显增多,但吗啡作用的各组间之间未见明显差异。3.2 p-eIF2α免疫组织化学染色结果与对照组相比,吗啡依赖1周组与3周组大鼠大脑皮层p-eIF2α阳性细胞数目逐渐增多;随着吗啡作用时间的进一步延长,吗啡依赖6周组p-eIF2α阳性细胞数目减少;急性吗啡中毒组阳性表达较正常组略有升高。吗啡依赖各组大鼠海马CA1区中神经细胞p-eIF2α阳性细胞数目与对照组相比均未见明显改变,急性吗啡中毒组阳性表达较对照组略有升高。3.3 ATF6免疫组织化学染色结果与对照组相比,吗啡依赖1周组与3周组大鼠大脑皮层及海马CA1区ATF6阳性细胞数目逐渐增多;随着吗啡作用时间的进一步延长,在吗啡依赖6周组ATF6阳性细胞数目减少;急性吗啡中毒组阳性表达较对照组略有升高。3.4 CHOP免疫组织化学染色结果对照组大鼠神经细胞胞浆及突起中CHOP呈现弱阳性表达状态,吗啡依赖1周、3周组阳性数目逐渐增多;随吗啡作用时间的进一步延长,6周组较前两组表达略有下降;急性吗啡中毒组阳性表达较对照组略有升高。3.5 Ki67及MAP2免疫组织化学双重染色结果吗啡依赖1周组、3周组、6周组大鼠侧脑室周围神经前体细胞Ki67阳性表达随吗啡依赖时间的延长与对照组相比呈下降趋势;急性吗啡中毒组阳性共表达较对照组未见明显改变。3.6 Nurrl免疫组化化学染色结果随吗啡依赖时间的延长,吗啡依赖各组中大鼠大脑皮层Nurrl阳性细胞数目与对照组相比逐渐减少;急性吗啡中毒组阳性表达较对照组未见明显改变。结论:本实验通过建立不同时程吗啡依赖大鼠与急性吗啡中毒大鼠模型,通过HE染色、硫堇染色及免疫组织化学,免疫荧光染色观察实验结果,得出以下结论:不同时程的吗啡依赖与急性吗啡中毒均可以不同程度的导致大脑神经细胞的损伤。ERS相关蛋白GRP78、p-eIF2α、ATF6、CHOP可能参与了神经细胞的损伤,同时,在吗啡依赖导致的神经损伤中,Ki67及Nurr1的表达呈下降趋势,提示吗啡影响了内源性神经干细胞的增殖及分化。
【关键词】：吗啡依赖 急性吗啡中毒 GRP78 CHOP p-p-eIF2α ATF6 Ki67 Nurr1
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：D919
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-15
• 材料与方法15-24
• 结果24-28
• 附图28-57
• 附表57-64
• 讨论64-67
• 结论67-68
• 参考文献68-71
• 综述 神经损伤后内源性NSCs活化增殖、分化、迁移与修复71-82
• 参考文献79-82
• 致谢82-83
• 个人简历83

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本文编号：343899