中国甜柿自然脱涩相关基因ADH和PDC的分离及功能验证

发布时间：2018-01-27 22:51

本文关键词： 中国甜柿单宁凝固乙醇脱氢酶丙酮酸脱羧酶瞬时转化　出处：《华中农业大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：中国原产完全甜柿(简称“中国甜柿”或CPCNA)自然脱涩性状受显性基因控制,而日本原产完全甜柿(简称“日本甜柿”或JPCNA)受隐性基因控制,因而中国甜柿较日本甜柿具有更重要的育种价值。中国甜柿自然脱涩机理明显有别于仅依靠“稀释效应”的日本甜柿,除“稀释效应”外可能还涉及单宁的“凝固效应”,即可溶性单宁与乙醛反应转变成不溶性单宁的过程。本研究以中国甜柿为试材,以非完全甜柿(non-PCNA)和日本甜柿为对照,首先从中国甜柿中分离参与乙醛代谢的两个关键酶基因:乙醇脱氢酶基因(ADH)和丙酮酸脱羧酶基因(PDC);进而通过分析其在不同脱涩类型(中国甜柿、日本甜柿和非完全甜柿)、不同发育阶段(花后5、10、15、20和25周)、不同部位(花、叶片、萼片、果皮、果肉、果心和种子)表达模式差异并结合单宁含量及乙醇和乙醛含量分析,筛选与中国甜柿可溶性单宁的自然凝固直接有关的目标基因;此外,通过构建瞬时转化体系,进一步确认候选目标基因的功能,以期从分子水平解析中国甜柿自然脱涩机理。主要研究结果如下:1.以GFP作为报告基因,基于农杆菌介导的注射渗透法,建立适宜栽培柿基因功能验证的活体叶片瞬时超表达体系。通过乙酰丁香酮浓度、菌液浓度和注射后不同采样时间对瞬时转化条件进行了优化,且该体系适用于不同脱涩类型柿品种‘磨盘柿’(non-PCNA)、‘鄂柿1号’(CPCNA)和‘宝盖甜柿’(CPCNA)。将DkLAC1瞬时转化‘磨盘柿’和‘鄂柿1号’叶片,发现DkLAC1表达导致两个柿品种叶片原花青素含量升高。2.基于农杆菌介导的注射渗透法,建立ihpRNA(发夹RNA)诱导的柿活体叶片基因瞬时沉默技术。DkPDS被选择作为内源报告基因,用于评价该瞬时沉默体系。利用该技术将pHG-LAR(DkLAR基因ihpRNA干涉载体)瞬时转化‘磨盘柿’、‘鄂柿1号’和‘阳丰’活体叶片,利用DMACA染色及Folin-Ciocalteau法测定原花青素含量,结果显示DkLAR瞬时沉默均导致柿叶片原花青素含量显著降低,表明DkLAR参与柿原花青素的生物合成。3.基于农杆菌介导的真空渗透法,建立柿组培苗瞬时转化体系。在真空渗透20min条件下GUS基因瞬时转化效率最高。利用该技术将pHG-LAR(DkLAR基因ihpRNA干涉载体)瞬时转化‘小果甜柿’和‘磨盘柿’组培苗,利用DMACA染色及Folin-Ciocalteau法测定原花青素含量,结果显示DkLAR瞬时沉默导致两个柿品种组培苗叶片原花青素含量显著降低。进一步证实DkLAR在柿原花青素生物合成中具有重要的作用。4.中国甜柿可溶性单宁累积持续到果实发育后期。在花后20-25周(WAF),其可溶性单宁含量迅速降低并完成自然脱涩过程,且不溶性单宁含量在果实发育后期(15-25 WAF)快速上升,表明中国甜柿自然脱涩可能涉及可溶性单宁的凝固。非完全甜柿果实直至成熟期其可溶性单宁含量仍维持较高水平。日本甜柿在果实早期(10 WAF前)停止可溶性单宁的累积,并通过“稀释效应”完成自然脱涩过程。5.从中国甜柿中分离3个ADH基因家族成员(DkADH1、DkADH2和DkADH3)和4个PDC基因家族成员(DkPDC1、DkPDC2、DkPDC3和DkPDC4)。其中DkADH1、DkADH2、DkADH3、DkPDC2和DkPDC3均获得cDNA全长序列,其ORF序列分别为1140 bp、1137 bp、1044 bp、1824 bp和1743 bp。6.ADH和PDC时空表达分析结果显示,在中国甜柿果实发育后期,即不溶性单宁含量快速上升期间(15-25 WAF),DkADH1、DkPDC1和DkPDC2特异性上调表达;且在种子中ADH和PDC高量表达,尤其是DkADH1、DkPDC1和DkPDC2。这表明DkADH1、DkPDC1和DkPDC2可能与中国甜柿单宁凝固具有密切的关系。7.不同发育时期果肉和种子乙醇和乙醛含量测定的结果表明,种子中乙醇和乙醛含量均高于果肉。中国甜柿和日本甜柿种子乙醛含量随果实发育不断升高,乙醇含量在果实发育早期较高,而后随果实发育不断降低。尤其在果实发育后期(20-25WAF),中国甜柿种子乙醛含量快速上升,与其不溶性单宁含量变化趋势一致。果肉中乙醇含量均随果实发育而不断降低。中国甜柿和非完全甜柿果肉乙醛含量也随果实发育不断降低,而日本甜柿与之相反。8.采用‘磨盘柿’叶片的瞬时遗传转化试验结果显示,DkADH1和DkPDC2超表达均能显著降低叶片可溶性单宁含量。综上所述,基于农杆菌介导的注射渗透和真空渗透法,本研究建立了柿活体叶片和组培苗的瞬时转化体系。研究结果认为,中国甜柿自然脱涩主要涉及单宁的“凝固效应”,且DkADH1、DkPDC1和DkPDC2在其自然脱涩过程中起关键作用。该研究结果为阐明中国甜柿自然脱涩特点提供了新的科学依据,并为选育具自主知识产权中国甜柿新种质奠定基因资源和技术基础。
[Abstract]:In this study , two key enzymes genes : alcohol dehydrogenase gene ( ADH ) and pyruvate decarboxylase gene ( PDC ) were isolated from Chinese sweet persimmon . The results showed that DkADH1 , DkPDC1 and DkPDC2 could significantly decrease the content of soluble tannin . The results showed that DkADH1 , DkPDC1 and DkPDC2 could significantly decrease the content of soluble tannin .

【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S665.2

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