cRGD-siRNA分子的合成、肿瘤靶向性、生物学功能及其作用机制研究

发布时间：2018-03-13 01:20

本文选题：cRGD-siRNA　切入点：肿瘤靶向性　出处：《南方医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景 siRNA,作为RNAi中重要组成部分,基于天然的细胞内基因沉默功能和降低靶基因表达的强有力工具,使其成为一种具有重大研究前景的新型治疗策略。目前已被广泛用于各种疾病治疗的基础研究。作为一种新兴的治疗技术,以一种前所未有的速度迈进了临床试验阶段。任何与疾病有关的表达基因都是潜在的靶标,从家族遗传疾病到肿瘤,再到病毒感染等。然而面临的一些亟待解决的问题限制了其在临床中的应用,包括siRNA分子在体内的稳定性,靶向于特定的组织/器官和潜在的非特异性(如脱靶作用和免疫反应)等。siRNA分子在体内的稳定性和特异性通过各种化学修饰已得到解决。虽然分子量大(～13KD)和强的负电荷是阻碍治疗分子siRNA有效地在体内发挥作用的最大障碍。但是目前各种对siRNA分子的修饰,包括将siRNA装配进阳离子聚合物和脂质体中形成纳米粒、整合到外合体中、和各种肽(抗体或核酸结合区域)结合形成复合物,以及siRNA分子共轭连接于肽转导区域、细胞特异性适体、受体特异性配体等这些措施有效地解决了这一难题,多种以RNAi为基础的药物也已进入临床试验。目前siRNA分子系统体内应用的最关键问题是设计制备合适的给药系统,突破细胞膜障碍,提高转染效率,靶向进入深层组织和细胞,使siRNA分子更像一种药物分子,选择合适的给药系统是临床应用siRNA分子的最大瓶颈。因此,为了临床疾病的治疗目的,需要大力研制能靶向性进入组织和器官的siRNA给药系统,以改善siRNA分子的靶向性,提高转染效率,发挥最大的疗效和减少副作用。整合素αvβ3在血管生成和肿瘤的转移中发挥着重要的作用,而且在肿瘤血管和各种侵袭性肿瘤细胞中整合素αvβ3的表达都明显升高,而在正常的静止期内皮细胞和组织中表达量较低,几乎不表达。而大量研究发现与肿瘤相关的整合素αvβ3和RGD肽具有高度的亲和能力。且RGD修饰的纳米粒或蛋白等等都可以选择性进入高表达αvβ3的细胞或组织。在肿瘤形成早期由于肿瘤组织低氧环境、癌基因激活以及代谢性应激的诱导,使得成熟血管休眠期被打破,促血管新生因子表达上调,发生血管新生。血管新生不仅在生长、繁殖、修复等过程中起着重要的作用,同时也对肿瘤形成、转移及其它许多非肿瘤疾病起决定性作用。如果没有血管的营养、血液以及氧的供给,肿瘤只能生长1-2mm,因而抑制血管新生为抑制肿瘤的关键,抑制血管新生相关信号通路为抗肿瘤热门靶点。VEGF/VEGFR2通路在肿瘤血管新生中起关键作用,血管内皮生长因子(VEGFs)和其相关的受体(VEGFRs)参与调节早期胚胎发育中前体细胞中的血管发育,到后期预先存在的血管中新生血管的形成。在实体瘤中,VEGF主要由肿瘤细胞生成,VEGF和VEGFR2结合进一步激活肿瘤血管多种重要的细胞通路。因此,有效地抑制肿瘤血管的生成,可抑制肿瘤的生长及转移。利用siRNA分子抑制VEGFR2的表达,可以达到治疗肿瘤的口的。本研究中,我们研制了一种具有自主知识产权、能容易产业化的靶向肿瘤新生血管及肿瘤细胞的siRNA给药系统：cRGD-siRNA分子；经血管途径给药后可介导各种siRNA分子进入肿瘤新生血管内皮细胞及多种肿瘤细胞,沉默靶基因的表达,发挥siRNA分子的生物学功能。目的 1.合成cRGD-siRNA分子并且对其结构进行鉴定。 2.体外研究cRGD-siRNA分子的细胞靶向性,细胞毒性以及基因沉默功能。 3.研究cRGD-siRNA分子抑制斑马鱼的血管生成作用。 4.体内肿瘤组织靶向性研究：经血管途径给药后不同时间,cRGD-siRNA分子在肿瘤裸鼠体内的肿瘤靶向性以及在体内的动态分布。 5.cRGD-siRNA分子的抑瘤生物学功能及其机制研究：研究系统途径连续给予cRGD-siRNA分子的抗肿瘤生长的生物学功能,及其机制(血管生成抑制、基因沉默、肿瘤细胞凋亡)；同时通过ELISA和血液化学检测体内给予cRGD-siRNA分子后的免疫刺激和毒副作用。方法 1.制备cRGD-siRNA分子用环状cRGD肽通过巯基与siRNA分子正义链的3’端共轭连接,用高效液相色谱(HPLC)对纯化后的cRGD-siRNA分子进行测定,cRGD-sense siRNA分子的分子量通过质谱分析进行测定。同时,选择阴性对照肽cRAD通过巯基与siRNA分子正义链的3’端共轭连接,得到cRAD-siRNA分子作为阴性对照分子。 2.cRGD-siRNA分子体外功能研究采用CCK-8检测方法评价cRGD-siRNA分子的体外细胞毒性。通过共聚焦显微镜检测Cy5标记siRNA分子在细胞中的分布,来验证cRGD-siRNA分子靶向性进入整合素αvβ3表达细胞的能力。采用RT-qPCR和western blot分别从mRNA和蛋白水平评价cRGD-siRNA分子在细胞中的基因沉默功能。用One Way ANOVA进行统计学分析；根据方差是否齐性选择LSD或者Dunnett T3检验,比较各组之间差异显著性 3. cRGD-siRNA分子抑制斑马鱼血管生成的研究本研究选用野生型斑马鱼和flk1-GFP转基因斑马鱼做为模型生物。在显微镜下挑选发育良好的斑马鱼胚胎(5hpf),放入6孔板中,每孔20个。通过显微注射将cRGD-siRNA (zVEGFR2,100μM,2nl), zVEGFR2(100u M,2nl), cRGD(2mg/ml,2nl)或ddH20(2nl)注射进5hpf的斑马鱼胚胎。然后置于28.5℃孵育,至24hpf和72hpf,分别采用荧光倒置显微镜和共聚焦显微镜检测血管发育状况。采用相对荧光密度对cRGD-siRNA给药后在斑马鱼体内对血管抑制情况进行定量。以Adobe Photoshop7.0软件记录多层扫描投射荧光集合(Z-stack Projection)。以灰度平均值记为荧光亮度,结果以各组荧光亮度与对照组之比进行统计分析。相对荧光密度以ddH20处理组进行标化。 4.系统给药后cRGD-siRNA分子在体内的肿瘤靶向性及分布研究。 cRGD-siRNA分子和裸siRNA分子经尾静脉给药后,通过小动物活体成像系统IVIS Spectrum (Xenogen)检测在肿瘤裸鼠体内的分布。当肿瘤体积达到约40-60mmm3时,首先用底物D-Luciferin对肿瘤(A549-1uc+细胞,表达luciferase)进行定位,然后给予lnmol Cy5标记cRGD-siRNA分子和Cy5标记的裸siRNA分子,接着采用小动物活体成像仪检测30min到24h中不同时间点,Cy5标记cRGD-siRNA分子和裸siRNA分子在肿瘤裸鼠中的分布。24h后,处死小鼠,取出肿瘤以及各个器官进行成像。同时采用Cy5标记cRAD-siRNA分子作阴性对照。 5.cRGD-siRNA分子的抑瘤生物学功能及其机制研究。对裸鼠皮下接种5×106个A549一luc+人非小细胞肺癌细胞以建立肿瘤模型,每隔三天测量小鼠体重及肿瘤体积。肿瘤体积以游标卡尺测量,计算公式为1/2×a×b2,其中a代表长直径,b代表短直径。待肿瘤长至40-60mm3,将荷瘤小鼠随机分组。每组小鼠尾分别静脉注射给予1nM cRGD-siRNAl (~0.753mg/kg; n=8),1nM cRGD-siRNA2(~0.753mg/kg; n=5),1nM cRAD-siRNA2(~0.753mg/kg; n=5), cRGD alone (~0.045mg/kg; n=5),1nM cRGD-si β-actin (~0.753mg/kg; n=5), cRGD-control siRNA (~0.753mg/kg; n=5)或生理盐水(n=10),终体积为150μL。每隔两天给予一次,共6次。肿瘤体积在每次给药前进行测定。或在特定的时间点,通过小动物活体成像系统IVIS Spectrum (Xenogen)检测肿瘤细胞的荧光强度。应用单因素重复测量方差分析比较给药各组肿瘤体积是否有统计学差异。并绘制肿瘤生长曲线和荧光表达曲线比较各组肿瘤生长是否存在差异。最后一次给药后48h,进行水合氯醛麻醉,眼球采血和剥离肿瘤组织,对肿瘤组织拍照后立即投入液氮以备RNA及蛋白提取分析。分离血清,通过ELISA检测细胞因子IFN-α,IFN-γ,IL-6和IL-12的表达量。全自动血液分析仪检测血清中ALT和Cr含量。免疫组化检测肿瘤组织切片中CD31的表达量。TUNEL检测肿瘤组织切片中细胞凋亡。用ANOVA对结果进行统计分析。结果 1.鉴定制备的cRGD-siRNA分子本课题制备并鉴定获得了cRGD-siRNAl(小鼠VEGFR2)、cRGD-siRNA2(小鼠VEGFR2)、cRAD-siRNA(小鼠VEGFR2)、cRGD-control siRNA(随机设计供对照)、cRGD-siRNAl (人VEGFR2)、cRGD-siRNA2(人VEGFR2)、cRAD-siRNA2(人VEGFR2)。典型cRGD-siRNA分子的结构示意图如图1-1A所示。HPLC测定纯化后cRGD-siRNA分子的含量高于90%,质谱测定cRGD-siRNA分子正义链的分子量为7975.3与预测的分子量7977.9相一致。20%SDS-PAGE凝胶电泳后,用花青染料SYBR Gold染色,结果显示cRGD-siRNA分子与裸siRNA分子相比有迟滞现象。 2.cRGD-siRNA分子体外功能 (1)在37℃孵育24h后,经过cRGD-siRNA和control siRNA(cRGD-NC-siRNA)处理后的细胞生长率分别为96.5%和96.0%,而阳性对照(Lipofectamine2000)/siRNA复合物为75.2%(P=0.000)。 (2)共聚焦显微镜结果显示在HUVEC细胞中存在大量Cy5标记的cRGD-siRNA分子,而在整合度αvβ3特异性抗体和cRGD肽封闭后转染的HUVEC细胞中无Cy5标记的cRGD-siRNA分子。cRAD肽封闭后转染的HUVEC细胞中也存在大量Cy5标记的cRGD-siRNA分子。但Cy5标记的cRAD-siRNA分子却不能进入HUVEC细胞中。 (3) qPCR结果显示经cRGD-siRNA1及脂质体转染的siRNAl分子沉默靶基因分别为80%及75%,二者间有统计学差异(P=0.022);Western blot研究表明,二者抑制靶蛋白分别为80%及70%,二者间无统计学差异(P=0.522)。cRGD-siRNA2分子沉默靶基因为66%,与对照组相比有显著差异(P=0.000);cRGD-siRNA2分子沉默靶蛋白为75%,与对照组相比有显著差异(P=0.009)。 3.cRGD-siRNA分子可抑制斑马鱼血管的发育。通过激光共聚焦显微镜观测了cRGD-siRNA VEGFR2分子对斑马鱼躯干部血管的影响。选择观察这一区域,是因为相比头面部血管,躯干部血管比较简单和规则,对这些血管的研究也比较透彻。斑马鱼胚胎中αv β3受体在48hpf开始表达,而斑马鱼胚胎发育中主要的血管,包括DA和腹侧静脉血管在24hpf完全发育。而新生血管主要在24hpf和72hpf之间发育。因此我们选择24h和72作为观测时间点。在给药处理后24hpf,通过荧光显微镜检测cRGD-siRNA和siVEGFR2处理组躯干血管发育受到抑制,但没有明显的差异。然而在72hpf,与ddH20处理组相比,cRGD-siRNA组斑马鱼的新生血管发育明显受到抑制,而且相对荧光强度的表达量约为48.8%,有显著差异(P=0.000)。在实验中发现因血管异常发育而导致畸形斑马鱼,及死亡的斑马鱼。 4.系统给药后cRGD-siRNA分子在体内的肿瘤靶向性及分布经尾静脉给予荧光标记(Cy5)cRGD-siRNA分子后30min到24h内,通过小动物活体成像仪检测均可发现肿瘤组织中的荧光分布；而经尾静脉同样给予Cy5标记的裸siRNA分子组在肿瘤部位未检测到荧光,主要存在于肾脏和肝脏。解剖后裸鼠的各个器官和肿瘤组织成像后的结果和活体成像的结果相一致。Cy5标记的cRAD-siRNA分子组在肿瘤部位也未检测到荧光,主要存在于肾脏和肝脏。 5.cRGD-siRNA分子的抑瘤生物学功能及其作用机制每隔两天经尾静脉给予荷瘤小鼠一次cRGD-siRNAl(小鼠VEGFR2),共6次。在各个时间点测定肿瘤的体积和肿瘤内荧光强度。最后一次给药后48h,处死小鼠,并取出肿瘤组织。进行RT-qPCR和western blot测定VEGFR2的mRNA和蛋白的表达量,表达量分别为均49.1%和42.2%,均存在显著差异(P=0.000和P=0.000)。VEGFR2的降低,反过来导致肿瘤的生长受到抑制(P=0.000),而肿瘤的荧光信号强度降低90%, P=0.000。同时,cRGD-siRNA2(小鼠VEGFR2)也有相似的药理学作用：mRNA水平的表达降低约45%,有显著差异(P=0.000),蛋白水平的表达降低65%,有显著差异(P=0.000),以及肿瘤体积的显著减小(P=0.000)和肿瘤内荧光强度的减弱约70%,P=0.005。不同序列的siRNA分子的结果进一步证实了沉默效能的序列特异性。TUNEL检测结果显示了cRGD-siRNA组肿瘤细胞凋亡的数量明显高于对照组cRAD-siRNA和生理盐水。而免疫组化分析的结果显示：与对照组cRAD-siRNA和生理盐水相比,由于VEGFR2的表达降低,cRGD-siRNA组中CD31的密度也明显降低。而在给药后6h和24h,和对照组相比,cRGD-siRNA组细胞因子IFN-α,IFN-γ, IL-6和IL-12,均没有表达量明显升高的差异。此外,与对照组相比,cRGD-siRNA组中肌酐和丙氨酸转氨酶无统计学差异,P=0.890和P=0.930。在cRGD-siRNA组和其他组中经过16天的治疗,并无死亡和体重降低的情况发生。结论： 1.环状RGD寡肽及对照RAD寡肽通过linker巯基-马来酰胺与siRNA分子正义链的3’端相连,经电泳及核磁鉴定成功合成了cRGD-siRNA分子。 2.cRGD-siRNA分子没有明显的细胞毒性。 3.cRGD-siRNA分子可以特异性进入表达整合素αvβ3的细胞中,提示该分子可经受体介导进入细胞；并有效沉默靶基因的表达,与脂质体介导的细胞摄入siRNA分子的沉默效率没有差异。 4.cRGD-siRNA分子(靶向斑马鱼VEGFR2)可能通过整合素αvβ3受体介导,可以有效地抑制斑马鱼胚胎新生血管生成。 5. cRGD寡肽修饰的siRNA分子(cRGD-siRNA)经小鼠尾静脉给药后,可靶向性分布于肿瘤部位,进入新生血管内皮细胞内,并介导靶基因的沉默。 6.cRGD-siRNA(小鼠VEGFR2)可抑制肿瘤的生长,且该生物学活性是通过沉默肿瘤相关基因的表达(VEGFR2)、抑制抗肿瘤部位新生血管的生成、及诱导肿瘤细胞凋亡等机制实现的。 7.实验期间体内应用cRGD-siRNA分子无免疫刺激、无明显的肝肾毒性,具有良好的耐受性。 8.cRGD-siRNA分子具有临床治疗肿瘤的应用前景。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R73-36

【参考文献】