结核分枝杆菌免疫优势CTL和Th1表位的筛选与鉴定

发布时间：2018-03-26 09:24

  本文选题：结核分枝杆菌　切入点：肺结核　出处：《南方医科大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景结核病(Tuberculosis, TB)是因人体感染结核分枝杆菌(Mycobacterial tuberculosis, MTB)而发生的慢性传染病,主要病灶是肺部,称为肺结核(Pulmonary tuberculosis, PTB)。近年来,随着人口流动的增加、HIV与MTB伴发感染、耐多药(multidrug-resistant)和广谱耐药(extensively drug-resistant)菌株的流行,使全球结核病死灰复燃,呈现卷土重来之势。全球1/3的人口感染了MTB,2014年新发结核病例960万、因结核病死亡150万。我国是全球第二大结核病高负担国,45%的人口感染了MTB,每年新发结核病例100万、因结核病死亡5万,相当于每10分钟就有1人死于结核!结核病严重危害人类健康,已成为重大的公共卫生问题和社会问题!快速、灵敏的诊断方法缺乏,造成结核病诊断延误或误诊。尽管抗生素的发明曾一度控制结核病的流行,但抗生素的用药疗程长达半年乃至一年,副作用明显,而且越来越多的结核病患者对多种抗生素产生了耐药性。据WHO统计,全球3.3%的新发病例和20%的复发病例为耐多药结核,其中9.7%为广谱耐药结核；我国是全球耐多药结核负担最重的国家之一,每年新发耐多药结核患者12万、广谱耐药结核患者近1万；前者治愈率不足50%,即使治愈后,人体很难完全清除体内的MTB,在自身免疫力降低时,容易复发；后者则基本无药可治。因此,疫苗仍是控制结核病流行的最佳策略。目前临床上唯一使用的卡介苗(BCG)在数十年的反复传代和保存中,已经缺失了一些毒力因子和免疫保护作用基因,以及环境分枝杆菌的干扰,使得BCG的保护效果更差,仅对预防儿童重症结核有效,对成人肺结核无显著的保护作用。因此,研制新型诊断试剂和疫苗势在必行!结核杆菌属于胞内寄生菌,体液免疫对其作用有限,在抗结核免疫反应中,作用最关键的是特异性T细胞,包括CD4+Th1和CD8+T细胞。活化的CD4+Th1释放IFN-γ、TNF-α等细胞因子,激活和趋化巨噬细胞,提高其对胞内结核菌的杀灭和抗原递呈能力。CD8+T细胞则发挥其细胞毒作用,特异识别和杀伤靶细胞,暴露并清除胞内寄生的结核杆菌。特异CD4+Th1和CD8-T细胞无法识别完整的结核抗原,仅识别由MHC分子递呈的抗原表位。因此,表位才是结核蛋白抗原性的基础。确定T细胞表位,对于表位疫苗设计、结核诊断试剂开发具有十分重要的意义。T细胞表位(epitope)是抗原中被T细胞表面受体(T cell receptor, TCR)特异性识别的抗原部分,又称为抗原决定簇。T细胞表位与MHC分子结合,通过与TCR相互作用,活化T细胞。目前,已知的MTB特异性T细胞表位约有800个,分布在170个不同的抗原蛋白；其中65%的已知表位集中来自30个最著名的MTB抗原,如ESAT-6、CFP-10和PPE家族蛋白,对于其它MTB抗原的表位,目前所知甚少。集中的抗原谱导致过窄的免疫应答,容易引起免疫耐受,不利于机体有效地抗结核。从MTB基因组选择抗原,筛选和鉴定抗原表位,有助于“拓宽”现有表位的免疫保护效应。T细胞表位是通过MHC分子提呈的,即具有MHC限制性。大量已知的MTB抗原表位是欧美白种人群携带MHC分子(如HLA-A*0201)递呈的；结核感染最严重的地区是非洲和东南亚等欠发达的国家和地区,适用于这些地区人群的T细胞表位严重缺乏。中国是世界上第二大结核高负担国,筛选和鉴定中国人群高频HLA提呈的MTB表位,有助于促进具有我国自主知识产权的抗结核疫苗和诊断试剂的研发。近年来,基于肽与MHC分子结合亲和力的表位预测,成为了表位筛选和鉴定的热点。目前,大部分的表位研究都是通过生物信息学预测获得高亲和力的候选表位,然后人工合成肽,逐一验证。传统的亲和力验证实验是一个费时费力的过程,利用紫外诱导肽置换技术,能快速、准确、大规模地验证表位与MHC分子的亲和力,更高效地找到免疫优势表位。本课题组从MTB全基因组选择目标抗原,运用生物信息学软件预测联合紫外诱导肽置换实验验证,初步筛选出与中国人群高频HLA分子高亲和结核的候选T细胞表位；进而利用临床样本,验证其抗结核免疫活性；并且利用肽-MHC多聚体,在肺结核患者外周血中检测到抗原特异性T细胞。本实验组最终鉴定出6条新的CTL表位和3条新的Thl表位,为研发适用于中国人群的肽表位疫苗、结核诊断试剂奠定重要基础。研究目的1.筛选和鉴定覆盖最广泛中国人群的HLA-A*1101限制性CTL表位,并且评价其抗结核免疫效应。2.筛选和鉴定覆盖最广泛中国人群的HLA-DRB1*0901限制性Th1表位,并且评价其抗结核免疫效应。研究方法1.检测结核患者HLA-A、HLA-DR等位基因频率T细胞表位的识别和递呈有MHC限制性。不同区域的人群,携带的HLA等位基因有很大差异。为了鉴定能够覆盖最广泛的中国人群T细胞表位,我们检测中国人群的HLA基因频率,寻找等位基因频率最高的HLA分型。我们从南方医院和广州市胸科医院一共收集了350名结核患者的外周血样本,利用测序分型技术(SBT),对结核患者HLA-A、HLA-DR位点进行高分辨基因分型检测。2.预测CTL表位和Th表位1) HLA-A*1101限制性CTL表位的预测①从Anat Zvi, ect al筛选的具有免疫优势的抗原中选择了45个MTB抗原蛋白：从Sylvie Bertholet, ect al鉴定的诱导IFN-γ分泌的抗原中选择了16个MTB抗原蛋白；另外,通过PubMed检索2008至2013年间报道新的MTB抗原蛋白,选择了33个MTB抗原蛋白。综上所述,最终筛选获得94个MTB抗原。②从结核数据库TB Database获取94个MTB抗原的氨基酸序列；使用CBS数据库上NetMHCcons方法预测HLA-A*1101限制性CTL表位。选取与HLA-A*1101分子亲和力最高的48条表位肽。2) HLA-DRB1*0901限制性Th表位的预测①选择了强免疫原性并广泛应用的MTB抗原38kDa (Rv0934)和Ag85A (Rv3804c)。目前表位数据库IEDB尚未有这两个抗原HLA-DRB1*0901限制性T细胞表位研究报道。②从TB Database获取38kDa和Ag85A的氨基酸序列；使用CBS数据库上NetMHCII方法预测抗原上的Th表位,选取与HLA-DRB1*0901分子亲和力最高的18个表位。3. HLA-A*1101限制性CTL表位的筛选和鉴定1)紫外诱导肽置换实验验证CTL表位与HLA-A*1101分子的亲和力合成含光敏型配体的p-MHC单体,将其与预测的CTL表位肽混合,紫外照射1小时。光敏型配体发生断裂而从MHC分子脱离,CTL表位与MHC分子结合形成新的p-MHC单体,并且亲和力越高,形成的单体越多越稳定。使用MHCI特异性ELISA检测新形成的p-MHC单体的量,确定预测的CTL与HLA-A*1101分子之间的亲和力。2) ELISA检测CTL、Th表位诱导肺结核患者PBMC分泌细胞因子CTL表位肽刺激6名HLA-A*1101(+)确诊结核患者的PBMC细胞。72小时后,ELISA检测上清中IFN-γ、TNF-α和GrB的分泌水平。3)ELISPOT检测分泌IFN-γ的CD8+T细胞频数及患者识别阳性率CTL表位肽刺激30名HLA-A*1101(+)肺结核患者的PBMC细胞,在ELISPOT板孵育24小时,检测生成的斑点数。设置阳性反应的标准,统计各CTL表位肽被患者识别的阳性率。4)CTL表位诱导肺结核患者CD8+T细胞增殖用CTL表位肽刺激来自HLA-A*1101(+)肺结核患者、HLA-A*1101(-)肺结核患者和HL-A*1101(+)健康志愿者的PBMC细胞,用CFSE对淋巴细胞进行染色,7天后,流式细胞术检测CD8+T细胞的增殖水平。5)表位肽-MHC多聚体检测肺结核患者肽特异性T细胞合成带APC荧光的HLA-A*1101多聚体(装载CTL表位p12),用于标记p12特异性T细胞。用多聚体标记4名肺结核患者的PBMC,流式细胞术检测p12特异性T细胞的百分比。6)检测CTL表位肽p12诱导CD69和CD107分子的表达及胞内细胞因子分泌用p12刺激HLA-A*1101肺结核患者的PBMC,6小时后,用表面标记抗体检测T细胞早期活化标志CD69和溶酶体相关膜蛋白CD107的表达水平。将T细胞破膜固定后,检测胞内IFN-γ、TNF-α和IL-2的表达水平。4.HLA-DRB1*0901限制性CD4+T细胞筛选和验证1) ELISA检测Th表位诱导Th1型细胞因子分泌用Th表位刺激10名HLA-DRB1*0901肺结核患者的PBMC细胞,72小时后,ELISA检测上清中Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α和Th2型细胞因子IL-4、IL-17的分泌水平。2) ELISPOT检测分泌IFN-γ的CD4+T细胞频数用Th1表位刺激来自HLA-DRB1*0901(+)和HLA-DRB1*0901(-)肺结核患者的PBMC,在ELISPOT板孵育24小时后,检测生成的斑点数。3)Th1表位肽诱导肺结核患者CD4+T细胞增殖用Th1表位肽刺激来自HLA-DRB1*0901(+)和HLA-DRB1*0901(-)肺结核患者的PBMC,使用CFSE染料标记细胞,7天后,流式细胞术检测CD4+T细胞的增殖水平。4)ICS检测Th1表位诱导细胞因子分泌用HLA-DRB1*0901限制性Th1表位肽p2刺激肺结核患者的PBMC,6小时后,检测胞内IFN-γ、TNF-α和IL-2的表达水平。统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行数据统计分析。所有计量资料结果用均数±标准差(standard error, mean±SE)表示。不同组之间的比较使用单因素方差分析(One-way ANOVA),多个实验组与一个对照组的均值比较方差齐时采用Dunnett-t检验,各组间两两比较方差齐时采用LSD法。两样本间的均数比较采用独立样本t检验(Independent-samples T Test)。当P0.05时,被认为差异具有显著意义。结果1.获得了中国结核患者HLA-A、HLA-DR等位基因频率分布为获得结核患者中HLAⅠ、Ⅱ类等位基因的频率,利用测序分型技术(SBT),对中国南方地区350名结核患者进行HLA-A、HLA-DR位点高分辨基因分型检测,证实频率最高的前五位与HLA等位基因权威数据库AFND (http://www.allelefrequencies.net)中国人群的结果一致。其中HLA-A*1101和HLA-DRB1*0901分别是HLA-A位点和HLA-DRB1位点等位基因频率最高的基因型,能够覆盖最广泛的中国人群。2.MTB抗原特异性CTL和Th1表位的预测和鉴定1)HLA-A*1101限制性MTB抗原CTL表位的预测和鉴定①抗原选择：通过筛选抗原的方法和设置的标准,获得了Rv0079等94个能够诱导人CD8+T细胞反应的MTB抗原。② HLA-A*1101表位：从结核数据库(TB Database)获得94个MTB抗原蛋白的氨基酸序列,采用CBS数据库中的NetMHCcons预测方法,预测与HLA-A*1101分子高亲和力的表位。选择了亲和力最强的48条表位,这些表位肽的IC5015nM。2) HLA-DRB1*0901限制性Th表位的预测和鉴定①抗原选择：通过检索IEDB,发现常见MTB抗原38kDa (Rv3804)和Ag85A(Rv0934c)并没有HLA-DRB1*0901限制性表位的报道,于是选取它们作为目标抗原。② HLA-DRB1*0901表位：从结核数据库(TB Database)获得了38kDa和Ag85A的氨基酸序列,通过CBS数据库中NetMHCIIpan预测方法,预测与HLA-DRB1*0901分子结合的表位。我们选取了IC5050nM的高亲和力表位肽,共计18条。3. HLA-A*1101限制性CTL表位的筛选及其免疫学功能验证1)通过紫外诱导肽置换实验,验证48条CTL表位肽与HLA-A*1101分子结合亲和力,其中22条预测表位肽与HLA-A*1101分子有强亲和力(阳性对照肽),将预测表位肽的序列与MTB蛋白组比对,确认了预测表位肽MTB蛋白来源的唯一性。2)通过不同的实验方法(ELISA法、ELISPOT法和ICS法)检测了22条预测表位肽活化CD8+T细胞和诱导细胞因子反应,发现其中6条表位肽特异性地诱导肺结核患者CD8+T细胞分泌IFN-γ (P0.05)。3)为验证6条免疫优势的CTL表位肽的MTB特异性和HLA-A*1101限制性,检测表位肽诱导HLA-A*1101(+)肺结核患者、HLA-A*1101(-)肺结核患者和HLA-A*1101(+)健康志愿者的PBMC中分泌IFN-y的CD8+T细胞的频数。结果显示,6条抗原表位肽刺激后,HLA-A*1101(+)肺结核患者PBMC中分泌IFN-y的CD8+T细胞的频数,显著地高于其它两组,结果具有统计学差异(P0.05)。4)为了进一步检测6条优势表位肽的免疫学活性,我们检测了它们诱导T淋巴细胞增殖的能力,发现它们能特异性地诱导HLA-A*1101(+)肺结核患者CD8+T细胞增殖(P0.05)。5)为了直接检测表位肽特异性T细胞,合成了肽-MHC多聚体(dextramer),利用多聚体标记,在HLA-A*1101(+)的肺结核患者PBMC中检测到显著水平的表位肽p12特异性CD8+T细胞(P0.05)。6)流式细胞术检测结果表明,优势表位肽p12诱导CD8+T细胞早期活化标志CD69分子和杀伤活性标志分子CD107a/b的表达上调；表位肽p12够诱导肺结核患者产生同时分泌两种或以上细胞因子的多功能CD8+T细胞。4.HLA-DRBl*0901限制性Thl表位的筛选及其免疫学功能验证1)通过不同的实验方法(ELISA和流式细胞术)检测18条Th表位肽诱导CD4+T细胞反应,发现其中6条诱导肺结核患者分泌Thl型细胞因子(P0.05)。2) ELISPOT检测6条优势表位肽诱导HLA-DRB1*0901(+)和HLA-DRB1*0901(-)肺结核患者的IFN-γ反应,发现6条表位肽诱导的IFN-y反应均能被anti-CD4抗体阻断(P0.05)；其中3条表位肽能特异性地诱导HLA-DRB1*0901(+)的肺结核患者PBMC分泌IFN-γ(P0.05).3)为进一步检测上述3条HLA-DRB1*0901限制性CD4+T细胞优势表位肽的免疫学活性,检测了它们诱导T细胞增殖的能力。结果显示,3条优势表位肽能特异性诱导HLA-DRB1*0901(+)肺结核患者的CD4+T细胞发生显著增殖,P0.05)。4)利用流式细胞术,检测到了表位肽p4够诱导肺结核患者产生同时分泌两种或以上细胞因子的多功能CD4+T细胞。结论1.通过HLA基因频率测序分型,获得了中国人群HLA-A和DR位点上的等位基因频率,为鉴定覆盖广泛人群HLA的MTB表位奠定基础。2.利用生物信息预测,结合实验验证的方法,鉴定了6条来自不同MTB抗原蛋白的HLA-A*1101限制性CTL表位；通过临床样本功能实验,验证了上述优势表位能诱导IFN-γ、TNF-α和GrB等细胞因子分泌,诱导CD8+T细胞增殖；通过肽-MHC多聚体标记,证实p12是自然递呈的表位。这些HLA-A*1101限制性表位肽为进一步研发疫苗或诊断试剂奠定基础。3.利用生物信息预测,结合实验验证的方法,鉴定了3条新的HLA-DRB1*0901限制性Thl表位,通过功能实验证明上述表位肽能够诱导IFN-γ、TNF-α等Thl型细胞因子分泌,诱导CD4+T细胞的增殖,为进一步研发多肽疫苗或诊断试剂奠定基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.911

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