A20人工锌指转录因子真核载体的构建及其对内皮细胞炎症反应的影响及其机制的研究

发布时间：2018-12-25 17:51

【摘要】：背景：缺血性脑血管病已成为临床上的常见病、多发病，致残率、病死率及复发率均高。近年来，影像学发展突飞猛进，血管内介入治疗脑血管病在临床上广泛开展，使缺血性脑血管病复发率、病死率显著降低。但是由于经皮血管成形术（percutaneoustransluminal angioplasty PTA）如支架植入、球囊扩张等导致血管狭窄部位局部损伤，引起血管过度修复反应，，导致术后再狭窄成为了该项治疗的发展的瓶颈。一项CREST试验研究表明，颈动脉支架术后，两年内再狭窄的发生率为6.0%，在吸烟、高血压、高血脂及糖尿病患者发生率更高[1]。因此再狭窄防治不容忽视。在血管成形术后再狭窄的病理生理机制研究中，人们发现血管内皮细胞的损伤是这一系列病理过程的始动因素[2]，可以引起血管平滑肌细胞病理性增殖等系列改变。而炎症反应在内皮损伤中起关键的作用[3]。因此，血管成形术以后炎症反应的防治成为了防治再狭窄的关键。目前大量研究表明A20基因是内皮细胞保护性基因，同时具有抗炎作用[4-5]，因此A20基因可能具有抑制再狭窄的作用。我们前期研究发现携带A20基因的血管内支架能明显改善支架术后再狭窄，说明通过A20修饰可构建具有抗再狭窄作用的血管内支架[6]。但是支架直接携带目的基因存在着效率低、稳定性差等问题。人工锌指转录因子（zinc finger artificialtranscription factor ZF-ATF）技术能够高效稳定地诱导目的基因表达。本课题主要构建A20基因ZF-ATF的真核表达载体，启动内源性A20基因的高水平表达，研究其生物学功能，为最终构建拥有自主知识产权的ZF-ATF修饰的血管内支架奠定基础。目的： 1.构建A20基因的人工锌指转录因子（ZF-ATF）的真核表达载体。 2.观察ZF-ATF转染人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）后对内源性A20基因的表达调控及对HUVEC细胞增殖、迁移能力的影响。 3.研究人工锌指转录因子对LPS诱导的内皮细胞炎症反应的影响并探讨其可能的机制。方法： 1.根据人A20基因ZF-ATF的序列，设计出其引物，以质粒DNApUC19-ZF-ATF为模板，通过PCR扩增出目的基因片段ZF-ATF，再通过BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切后的载体连接产生ZF-ATF真核载体，重组质粒转化感受态细菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒，限制性内切酶酶切鉴定，鉴定阳性克隆进行测序。 2. ZF-ATF转染HUVEC细胞，用含G418300μg／mL的1640培养液进行稳定细胞株的筛选。 3.通过Western blot检测转染ZF-ATF后内皮细胞内源性A20蛋白的表达。 4. MTT实验观察转染ZF-ATF后HUVEC细胞的增殖能力，transwells实验检测HUVEC细胞迁移能力。 5.用脂多糖（LPS）诱导HUVEC细胞产生炎症反应，利用Western blot检测NF-κBp65的表达情况，利用ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-8等。 6.实验数据采用GrapPad Prism5软件处理，Mann-Whitney U检验用于比较炎症因子的差异。结果： 1.通过限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序证实ATF插入正确，成功构建A20人工锌指转录因子的真核表达载体。 2. ZF-ATF转染HUVEC细胞，成功筛选出HUVEC细胞稳定表达系，Western blot证实ZF-ATF转染HUVEC后内源性A20蛋白表达量显著增加（P＜0.01）。 3. ZF-ATF转染HUVEC细胞后抑制了其增殖能力，增强了迁移能力。 4. ELISA法检测结果表明，LPS刺激前后，空载组及空白组细胞因子表达存在统计学差异，LPS刺激后均明显上调(空白组IL-6:126±28.8vs738±70.1， IL-8：110±33.9vs724±72.3，TNF-α：9.8±1.5vs41±8.9，P＜0.05；空载体组：IL-6：134±11.4vs712±110.3，IL-8：110±29.1vs762±10.6， TNF-α：7.6±2.3vs42±9.1P＜0.05)，ZF-ATF转染组细胞因子也有明显上调（IL-6:130±35.4vs292±44.9， IL-8：96±18.2vs328±76.3，TNF-α：7.2±2.6vs21±4.2P＜0.05），但ZF-ATF转染组细胞因子的上调水平没有空白组及空载组上调水平高，存在统计学差异（IL-8、IL-6P＜0.01，TNF-α P＜0.05），ZF-ATF转染组与空白组比较细胞因子表达存在统计学差异（IL-8、IL-6P＜0.01，TNF-α P＜0.05），而空载组与空白组比较LPS刺激前后细胞因子的表达均无统计学差异（P＞0.05）。Western blot证实在LPS刺激后ZF-ATF转染组NF-κB p65的表达（19.8±4.5）较空载组（90.2±5.9）及空白组（96.3±3.3）显著下调（P＜0.01）。结论： 1.成功构建人工锌指转录因子真核表达载体，且能够启动内源性A20基因的稳定表达。 2. ZF-ATF转染内皮细胞能够抑制内皮细胞的增殖，增强内皮细胞的迁移能力。 3. ZF-ATF转染内皮细胞能够抑制LPS诱导的内皮细胞炎症反应，其机制可能与A20通过阻断NF-κB通路有关。 4. A20通过阻断NF-κB通路抑制炎性细胞因子的表达。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R743.3

【参考文献】