调控paraspeckles和神经干细胞小分子化合物高内涵筛选模型的建立与优化

发布时间：2018-12-27 20:35

【摘要】：高内涵筛选技术(high content screening, HCS)是根据在细胞内获取多个靶标的荧光数据,而建立起来的筛选方法。并且HCS能够在保持细胞结构和功能完整性的前提下,检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导等各个环节的影响。此外,HCS还能在单一实验中获取大量与基因、蛋白及其他细胞成分相关的信息,确定其生物活性和潜在毒性。同时,HCS也是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统,旨在获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息,在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术平台,它是交叉多个学科的方法。本论文主要开展调控paraspeckles新型小分子化合物的高内涵筛选的建立与优化及神经干细胞高内涵筛选模型的建立与优化这两方面的工作。 Paraspeckles是最新发现的位于哺乳动物染色体区间的亚细胞核结构体,由长链非编码RNA-NEAT1与DBHS蛋白家族构成的结构复杂的RNA-蛋白复合体。Paraspeckles通过识别RNA的3’端非编码区域存在的经A-to-Ⅰ编辑的反向重复序列,将特定RNA滞留于核内,调控相关基因的表达。在多种细胞生命活动过程中如应激反应、细胞分化和病毒感染等,paraspeckles结构体能有效调控基因表达,参与生理病理过程。但是迄今为止,paraspeckles的具体功能和调控机制还不是非常明确。本课题拟以细胞核中paraspeckles结构体数量的显著性变化为指标,通过高内涵筛选化合物库,希望获得可有效调控paraspeckles结构体数量的小分子化合物,并以其为探针工具对paraspeckles结构体调控机制及生理功能进行更加深入的研究。本论文中,在前期构建过表达EYFP-PSP1α的HEK293细胞系和鉴定EYFP-PSP1α能够标记paraspeckles结构体在细胞中的定位与数量的基础上,优化高内涵筛选模型相关条件,如细胞密度、细胞板的选择、免疫组化实验步骤、荧光成像拍摄条件等,以及根据paraspeckle实际大小,调整高内涵数据图像分析参数如荧光点的长、宽、体积及荧光强度等参数,从而确立高内涵筛选模型及分析条件,Z’因子为0.71,符合筛选质控要求。进一步对具有生理活性的2560个天然产物和生物活性分子库中的1906个已知功能的药理活性分子进行快速、大批量筛选,在4466个化合物中,发现140个化合物可显著改变细胞中paraspeckles数量的新型化合物。之后,对筛选出的化合物进行复筛,确定12个化合物可以显著降低细胞内paraspeckles的数量。最后,使用Vestern Blotting、荧光原位杂交和Northern Blot对筛选出的化合物进行验证,发现这些化合物确实能够减少NEAT1(?)勺表达量,证明该高内涵筛选模型的可行性。下一步,我们将计划以筛选到的小分子化合物为工具探针,进一步研究相关信号通路对paraspeckles的调控机制及其可能的生理病理意义。神经干细胞是一群具有分化为神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力,可自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞群。神经干细胞的研究是目前神经科学研究的前沿领域,不仅因为其对神经发育研究的重要性,更主要的是其对神经退行性疾病具有潜在的治疗价值。无论是体外神经细胞的移植还是内源性神经的激活,首先都需要充分了解神经干细胞在生理或病理过程中增殖和定向分化的精密调控机制,从而实现高效可控的诱导其分化产生功能神经元或特定类型神经胶质细胞。最近几年,化学生物学研究方兴未艾,基于化学生物学研究发现小分子探针不仅可作为重要的工具化合物有力推动神经干细胞的基础研究,更由于其结构简单、易于进入血脑屏障和进一步结构优化的特点,具有基于干细胞研究方向的新一代药物研发前景。此外,对神经干细胞定向分化诱导的探索也将为我们的中药现代化研究带来新的切入点。因此,本课题拟建立神经干细胞定向分化高内涵筛选模型,希望通过对国家化合物样品库具有结构多样性的天然产物库、生物活性分子库及多样性库进行大量、随机、准确的筛选,找到能高效调节神经干细胞定向分化的诱导剂并对其作用机制作进一步探讨,这不仅有助于深化对神经干细胞分化调节机制的认识,而且有望找到具有自主知识产权的先导化合物作为治疗神经退行性疾病等中枢神经系统损伤的药物。本论文中,首先分离E12.5-E13.5天原代胚胎大脑皮层神经干细胞,进行单层培养。利用增殖培养基及分化培养基培养及处理神经干细胞,免疫细胞化学染色技术检测神经干细胞标志蛋白Nestin、神经元标志蛋白β Ⅲ-Tubulin及星型胶质细胞标志蛋白GFAP表达量,鉴定所分离传代培养的神经干细胞具有自我更新和分化能力。确认用于高内涵筛选所用的神经干细胞原代分离条件如小鼠品系确定、孕鼠天数、分离部位、分离方法、细胞代数、细胞传代条件、细胞贴壁培养等。然后建立和优化高内涵筛选模型相关条件,包括细胞接种密度、分化过程中是否半数换液、分化时间和DMSO浓度、成像条件、免疫组化条件等,以及确定高内涵图像分析参数,包括通过细胞核染色荧光强度确定研究对象,通过β Ⅲ-Tubulin免疫荧光强度确定神经元数量等。以GSK3-beta抑制剂BIO为阳性化合物,计算Z’-因子为0.45,属于可接受范围。下一步,我们将对国家化合物样品库具有结构多样性的天然产物、生物活性分子库及多样性库进行随机、准确的筛选,希望找到能高效调节神经干细胞定向分化的诱导剂并对其作用机制作进一步探讨。
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【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R965.1

【共引文献】