新型孪药川芎醇卡尼酯系列化合物对缺血性脑中风的保护作用

发布时间：2018-12-30 18:24

【摘要】：研究目的缺血性脑中风是一类常见的脑血管疾病,具有发病迅速、病情复杂、致死和致残率高等特点,被认为是本世纪最具有"影响力"的神经系统疾病,严重危害人类健康。目前在临床上针对该病的治疗措施仍以药物和手术溶栓为主,但由此带来的再灌注损伤使患者遭受新的打击。近年来越来越多的临床研究提出缺血性脑中风的最理想治疗方案是"超早期溶栓治疗+神经保护剂",但遗憾的是,迄今为止世界上尚没有得到权威机构认可的满意的抗缺血性脑中风的神经保护药物上市。其中一个重要的原因是现有的治疗策略主要针对单一的致病因素,缺乏多靶点抗缺血性脑中风的药物;而血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)对药物在神经系统分布的制约也成为影响其神经保护作用发挥的重要因素。因此寻找理想的神经保护药物成为当今缺血性脑血管病治疗的瓶颈,研究开发新型的神经保护剂,具有很高的理论意义和应用价值。卡尼汀具有分子小、脂溶性高及高效载体转运等特点,这些特点使其神经系统靶向作用增强,而其支链衍生物进一步增加了血脑屏障的通过率,选作本研究中的重要的前体结构;川芎嗪是具有活血化瘀作用的中药川芎的有效成分之一,临床上主要用于治疗缺血性心血管疾病,川芎醇(tetramethylpyrazine,TMP)是川芎嗪的体内活性代谢产物,其细胞保护活性强于前体。以此为基础,根据前药设计的原理将卡尼汀进行支链修饰,进一步增加脂溶性,并与川芎醇经共价键连接,拼合在一个分子内形成新型孪药(twindrugs)一川芎醇卡尼酯系列化合物。本研究使用大脑中动脉栓线阻断法(MCAO)和糖氧剥夺/再复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)建立体内外脑缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤模型,对新型孪药川芎醇卡尼酯系列化合物神经保护作用进行了系统的筛选和评价,并从炎症反应,氧化应激,能量代谢障碍以及线粒体结构和功能的完整性等方面探讨其发挥神经保护作用的可能机制。实验方法与结果1川芎醇卡尼酯系列化合物神经保护活性的筛选体外培养高分化PC12细胞,OGD/R方法模拟体内缺血再灌注损伤,CCK-8检测试剂盒测定细胞的存活率。通过对不同浓度的10个受试化合物的神经保护作用进行筛选,并计算半数有效浓度(EC50)值,发现化合物LR134,LR137,LR140,LR143的EC50值低于100nM,用于后期体内实验。因化合物LR134的EC50值最小,以此进行体内给药剂量和给药时间的筛选。采用大脑中动脉栓线阻断法建立局灶性缺血再灌注损伤模型。在充分预实验的基础上,设定术前120min,30min和术后Omin三个给药时间,1.25,2.5,5 mg/kg三个给药剂量。TTC染色、神经行为学评分及水肿指数结果显示术前120min给药无明显神经保护作用,术前30min和术后立即给予2.5,5mg/kg化合物LR134可显著降低脑梗死体积,改善神经行为学功能,减轻脑水肿。选取发挥神经保护作用的最小有效浓度2.5mg/kg(换算成摩尔浓度为6.82μmol/kg)作为给药剂量。前期药代动力学研究显示,化合物LR134给药30min后在脑组织分布达高峰,与术后Omin给药相比,术前30min给药具有更好的神经保护作用,因此选取术前30min作为给药时间。2川芎醇卡尼酯系列化合物的神经保护作用术前30min给予6.82μmol/kg的川芎醇卡尼酯类化合物LR134,LR137,LR140和LR143,并以其前体化合物L-卡尼汀和川芎醇作为对照。结果显示除化合物LR134外,LR143对局灶性脑缺血再灌注损伤也具有显著的神经保护作用,但在此剂量下的化合物LR137,LR140及前体L-卡尼汀和川芎醇没有明显的神经保护作用。进一步使用苏木素伊红染色(Hematoxylineosin,HE)和尼氏染色(Nissl)染色的方法,发现化合物LR134和LR143可显著减轻缺血再灌注引起的神经细胞变性、损伤,明显改善神经元的存活状态。使用荧光标记的TUNEL试剂盒,发现化合物LR134和LR143可显著减少脑缺血再灌注引起的脑组织细胞凋亡。进一步证实新型孪药川芎醇卡尼酯系列化合物LR134和LR143对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用。3川芎醇卡尼酯系列化合物LR134和LR143神经保护作用的机制缺血性脑中风的发病机制非常复杂,研究认为与炎症反应、氧化应激、能量代谢缺陷、线粒体功能障碍和Ca2+超载等有关,本实验即从这几方面入手,对川芎醇卡尼酯类化合物神经保护作用机制进行初步探讨。分别使用实时定量RT-PCR和免疫荧光染色法(immunofluorescence,IF)检测脑组织中炎症因子的mRNA水平和炎性细胞的浸润情况,结果显示化合物LR134和LR143可显著减低缺血再灌注损伤引起的炎症因子的过度表达及中性粒细胞和巨噬细胞的浸润。用电子自旋共振(Electron Spin Resonance,ESR)波谱法检测脑组织中超氧阴离子(O2·-)水平,结果表明化合物LR134和LR143可显著减少缺血再灌注产生的超氧阴离子。免疫印迹法(Western-blot,WB)发现化合物LR134和LR143可以显著降低脑缺血再灌注损伤模型中NADPH氧化酶(NADPH oxidase)NOX2的表达,而使用免疫荧光双标的方法证实缺血再灌注会引起脑组织神经元细胞中NOX2的表达显著增加,这种变化可以被两种候选化合物所缓解。应用透射电子显微镜(TME)观察神经元和线粒体的超微结构,发现化合物LR134和LR143均可显著减轻脑缺血再灌注损伤中脑组织皮层神经元和线粒体结构损害。提取脑组织皮层线粒体,通过免疫印迹法分别检测脑组织胞浆和线粒体中的细胞色素C的蛋白表达量,结果表明化合物LR134和LR143可抑制缺血再灌注引起的线粒体细胞色素C向胞浆释放。荧光素酶法检测脑组织中ATP含量,WB检测各组脑组织中能量感受器AMPK的磷酸化水平,结果显示化合物LR134和LR143能够显著改善能量代谢缺陷,并纠正由缺血再灌注引起的AMPK的过度激活。体外实验也得到相似的结果。结论与创新性结论:川芎醇卡尼酯系列化合物对缺血性脑中风具有神经保护作用,其机制与减轻缺血再灌注炎症反应、保护线粒体结构和功能、改善能量代谢缺陷及减少细胞内钙超载等有关,有望发展成为临床上用于缺血性中风的具有自主知识产权的新型神经保护剂。创新性:本实验所用的川芎醇卡尼酯系列化合物完全自主设计、研发、合成的具有全新结构的单体化合物;本研究首次通过体内外实验对新型孪药川芎醇卡尼酯系列化合物的神经保护活性进行系统的筛选和评价;首次对新型孪药川芎醇卡尼酯系列化合物对缺血性脑中风的保护作用机制进行探讨。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【相似文献】