超声在肿瘤诊治中应用研究—经直肠超声在直肠癌分期及脉冲式海伏热疗生物学效应研究

发布时间：2019-01-28 19:53

【摘要】：第一部分环扫型经直肠腔内超声检查在直肠癌术前分期诊断中的应用价值研究背景结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一。在我国和西方发达国家其发病率及死亡率均居恶性肿瘤谱前列。我国结直肠癌的发病率上升迅速,多数大城市结直肠癌的发病率位居第2或第3位。今天,直肠癌的治疗策略正面临着追求根治以降低局部复发与倡导保存功能以提高生活质量的困惑之中,肿瘤的综合治疗需考虑到生存及其质量的共同获益,针对适应征患者实施新辅助化放疗以提高根治切除率已获得广泛共识。强调诊断优先和临床分期诊断以指导个体化的治疗决策,强调治疗决策制定前的多学科评估和客观的分期诊断是规范化、个体化的诊治理念得以深入贯彻的关键,准确的术前分期评估是指导直肠癌外科治疗的前提条件目的探讨环扫型经直肠腔内超声(ERUS)检查在直肠癌术前分期诊断中的应用价值。方法选择2010年2月至2011年9月在浙江大学第二附属医院肿瘤外科接受手术治疗的110例直肠癌患者,使用超声诊断仪和经直肠腔内环扫探头进行ERUS检查,观察直肠壁的层次及直肠肿块的大小、形态、回声、位置、范围、血流情况、肠壁浸润深度附近组织受累情况和邻近淋巴结转移情况,进行术前TNM分期,并与术后病理结果对照。结果 110例直肠癌中,ERUS诊断uT1期30例,uT2期23例,uT3期47例,uT4期10例。ERUS对直肠癌T分期诊断的总准确率为91.4%,对T1期、T2期、T3期和T4期诊断的准确率分别为92.7%、88.2%、88.2%和96.4%；对T1期、T2期、T3期和T4期诊断的敏感性分别为92.3%、72.7%、85.4%和71.4%；对T1期、T2期、T3期和T4期诊断的特异性分别为92.9%、92.0%、90.3%和100.0%,与病理T分期的一致性较好(Kappa=0.75,P0.001)。ERUS诊断uN0期79例,uNl-2期31例。ERUS对直肠癌N分期诊断的总准确率为85.5%,对NO期和N1-2期诊断的准确率均为85.5%；对N分期诊断的敏感性、特异性分别为74.2%、89.9%,与病理N分期的一致性较好(Kappa=0.64,P0.01)。结论环扫型ERUS对直肠癌浸润深度、范围以及肠周淋巴结转移的诊断具有较高的准确性,且操作简便、患者痛苦小,是直肠癌术前分期诊断的有效检查方法。第二部分超声弹性成像在直肠癌术前分期及直肠良恶性肿块鉴别诊断中应用价值研究背景自从1991年Ophir等首次提出了“弹性成像”的概念后,通过弹性分级对弹性声像图上组织硬度进行评估已广泛用于乳腺、甲状腺、前列腺、肝脏疾病良恶性肿瘤等鉴别诊断和肝脏纤维化程度评估中,而在直肠肿瘤中应用尚未见报道。目的本研究探讨超声实时组织弹性成像技术在直肠肿块良恶性鉴别诊断及直肠癌术前分期中的应用价值。方法对85例直肠肿块应用实时组织弹性成像技术将弹性图分为1—5级,同时获得肿块应变率与周围正常组织应变率比值,与术后病理结果进行对照分析。结果 (1)直肠痔疮、腺瘤等良性肿块弹性应变率比值为2.06±1.01,恶性组弹性应变率比值分别为1.36±1.14,3.61±1.95；而恶性病灶弹性应变率比值分别为T1：23.0±25.8、T2：39.9±45.7、T3：61.0±51.2和T4：60.5±36.2。痔疮与腺瘤间无显著性差异,p0.05；尽管T1、T2与T3、T4间有显著性差异,但两组间有较大交叉重叠。 (2)直肠良恶性肿块弹性5分法的ROc(受试者工作特征曲线)曲线下面积为0.943,差异有统计学意义(P0.05)。 (3)通过ROc曲线确定良、恶性肿块弹性5分法临界点为3.5,其灵敏度、特异性、分别为81.5%、100%；恶性肿块弹性应率比值的临界点为3.6。 (4)将T1-2设为早期癌,T3-4设为晚期癌,制作ROC曲线,以灵敏度为纵坐标,1-特异度为横坐标,建立直肠肿块早期晚期弹性5分法ROC曲线,曲线下面积为0.679,与AUC(曲线下面积)=0.5比较,差异无统计学意义(P0.05),说明弹性超声对直肠肿瘤术前分期无价值。结论超声实时组织弹性成像技术可以简便、无创、定量地对直肠肿块良、恶性进行鉴别诊断,但对直肠癌术前分期无价值。第三部分不同温度梯度下热疗对人乳腺癌细胞生物学效应体外研究研究背景热疗(hyperthermia)(?)台疗肿瘤是应用各种致热源的热效应,将肿瘤区或全身加热至有效治疗温度范围并维持一定时间以杀灭肿瘤细胞的一种方法。肿瘤局部热疗(如高能聚焦超声、微波、射频、激光等)是利用各种物理能量在人体组织中所产生的热效应,使组织细胞温度升高至有效治疗温度,并维持一定时间,达到加速癌细胞坏死,导致细胞功能不可逆损伤或由于热诱导使细胞对离子辐射和特定细胞药物敏感,而正常细胞组织损伤较小的一种方法。但由于肿瘤的形状与深度不一,加热后肿瘤组织内温度分布不均匀一直是一难点；其次,当肿瘤体积较大时,难以杀死肿瘤边缘的肿瘤细胞,从而导致肿瘤复发；另外,肿瘤热疗的有效安全温度较窄,温度过高容易损伤正常细胞,临床治疗时会引起患者的热痛感。肿瘤全身热疗是利用实体肿瘤的微血管及血流特点,全身加温时瘤体产生热积聚,温度高于周围组织,破坏瘤体的微环境,以及损害瘤细胞细胞膜、抑制DNA、RNA等而直接杀灭肿瘤细胞,目前医学上全身热疗方式主要有红外线直接辐射和体外循环加热等两种方式,全身热浴(水、蜡、空气等)由于其副作用大、治疗费用高等问题已经渐渐被淘汰。近年来超声波介导的药物或基因靶向治疗技术由于其定位准确、相对安全和操作简便得到关注。其机制包括超声的热效应和非热效应,其非热效应包括空化效应、辐射力和微射流。但有研究表明超声在介导细胞增强摄入的过程中是热效应所致,并非非热效应。从本研究第二部分脉冲式高强度聚焦超声(pHIFU)生物学效应研究中我们通过SEM(扫描电镜)发现,治疗后的细胞表面绒毛变稀、变短、变粗甚至消失,细胞表面可见多个宽大的孔,故我们拟研究温热对细胞的生物学效应以更好地理解和诠释超声温热效应在介导药物或基因治疗的机理。目的探讨不同温度、不同治疗时间对体外培养的人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的形态学变化、细胞膜通透性改变、增殖、生存以及迁移能力的影响,探讨其在增强抗肿瘤化疗药物疗效中应用价值、机理及安全性。方法 MDA-MB-231细胞接种于8孔腔室玻片里,分别用43℃,45℃,50℃水浴治疗3分钟、10分钟、15分钟、30分钟,用台盼蓝染色,测定其细胞存活率；MDA-MB-231细胞接种于8孔腔室玻片里,5uM calcein加入8孔腔内,用43℃,45℃,50℃水浴分别治疗3分钟、10分钟、15分钟、30分钟,荧光显微镜观察细胞摄取钙黄绿素(calcein)检测细胞膜的通透性并用酶标检测仪测定其吸光值；细胞接种于6孔板内,分别分别用43℃,45℃,50℃水浴治疗3分钟、10分钟、15分钟、30分钟,用200u1枪头划痕后,分别即时、12小时、24小时、36小时、48小时拍照,检测其迁移能力变化；将5×7mm硅片粘在8孔腔室底部,70%乙醇浸泡20分钟后紫外线消毒1小时,接种MDA-MB-231细胞于其内,分别用43℃,45℃,50℃水浴治疗3分钟、10分钟、15分钟、30分钟,梯度脱水、干燥和喷金后,SEM(扫描电镜)观察其形态学变化；细胞接种于96孔板内,紫杉醇、秋水仙碱不同浓度梯度下分四组(对照组,温热组,药物组,温热加药物组),45℃15分钟治疗后分别一天、两天、三天MTT法测定细胞存活率,评价其疗效。结果 1、温热对乳腺癌细胞增殖和存活的影响与温度及治疗时间呈正相关。在一定的时间下,其温度越高,生物学效应越明显,细胞死亡率也相应增加；在一定时间内,温热治疗时间越长,其生物学效应越明显,但43℃治疗其细胞存活率与治疗时间无明显关系。 2、用image J软件分析划痕实验图像,结果示治疗后细胞迁移能力明显下降。 3、细胞表面形态改变(SEM):示细胞形态和温度及时间呈正相关,随着温度增高,时间延长,细胞表面的绒毛呈现变粗、变短,甚至消失,表面出现较大的孔。 4、细胞毒和增殖抑制试验(MTT法)示热效应与药物治疗及对照均有明显差异,热效应加药物治疗在治疗第三天与单热效应治疗效果有显著差异。结论我们的结果说明温热治疗可以增加细胞膜的通透性和细胞的摄入能力,降低细胞的迁移能力,温热联合化疗可以提高化疗药物的细胞毒性,有可能成为改善HIFU.射频和微波治疗肿瘤过程中防止肿瘤复发的一种安全有效的新策略,为后续研究pHIFU热疗提供方法学基础及理论依据,为进一步体内实验提供实验研究基础。第四部分脉冲式海扶(pHIFU)热疗生物学效应：肿瘤靶向药物释放的机理及生物安全性体外研究研究背景近年来,超声在肿瘤治疗中的作用已成为新的研究热点,如肿瘤的高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound,HIFU)。HIFU具有聚焦性高、组织穿透力强、指向性好、可体外聚焦等优点,其通过一定形式的超声聚焦换能器、单元换能器或多元换能器阵将体外低能量的超声波穿过皮肤汇聚于体内肿瘤靶区,焦点区高能量超声波产生高温效应、空化效应、机械效应等,瞬间达到70。C-90℃以上,导致靶区肿瘤组织蛋白质凝固性坏死或产生直接的细胞毒作用,对肿瘤细胞产生杀伤作用,造成肿瘤组织破坏而对邻近组织则极少或不产生损伤,故已被广泛应用于临床肿瘤及非肿瘤疾病的治疗,尽管高强度聚焦超声(HIFU)可以实现热消融治疗肿瘤,但高能聚焦超声治疗肿瘤的主要原理是升温作用,由于它所产生的局部高温不易控制,而且对肿瘤深部的温度不易测量。在热导向的肿瘤药物靶向治疗中,需要对靶部位加热至某一特定温度,在靶部位形成较高的药物浓度,对周围的肿瘤细胞产生较强的杀伤作用,从而达到局部化疗的作用,避免对正常细胞的损害。目前医学上全身热疗方式主要有红外线直接辐射和体外循环加热等两种方式,全身热浴(水、蜡、空气等)由于其副作用大、治疗费用高等问题已经渐渐被淘汰,与传统的热疗相比,脉冲式聚焦超声(pulsed high intensity focused ultrasound, pHIFU)(?)台疗具有许多优点：可以产生非连续性能量沉积,从而降低暂时的平均强度并产生轻微的温度升高,短的脉冲和较短的工作周期(duty cycles)可以产生只有4℃-5℃的温度升高,从而被用于非侵害性增强大分子肿瘤局部释放,改善治疗疗效；声束聚焦使超声波可以深入人体,实现对深部病变组织的治疗；小的治疗焦斑使高精度治疗成为可能,从而避免正常组织受到损伤；由于脉冲式聚焦超声治疗时间短,因而大大提高了治疗效率；其次是现代医学影像技术高度发展,为把聚焦超声能量准确投向靶组织并及时反馈靶组织经超声聚焦处理后的变化信息,提供了充分的现实可能性。超声促进药物释放最初是从超声透皮给药治疗关节炎开始,从那开始,超声透皮给药有了广泛的应用。近年来,已经有大量的临床前研究在探讨超声在增强抗肿瘤药物的疗效中应用,在大多数这样的研究中超声诱导高热既可以直接治疗小的局限性的肿瘤,又可以作为辅助治疗增加放疗和化疗的疗效,但超声增强化疗疗效的确切机制目前还不清楚。目的探讨不同声压的脉冲式高强度聚焦超声(pulsed high intensity focused ultrasound,pHIFU)对体外培养的人MDA-MB-231细胞、MIA-Paca2细胞、U87细胞、SAOS-2细胞骨架改变,并选用乳腺癌细胞(MDA-MB-231)进一步研究其形态学变化、增殖、生存以及迁移能力的影响、探讨其在增强抗肿瘤化疗药物疗效中应用价值、机理及安全性。方法 MDA-MB-231细胞接种于8孔腔室玻片内,探头频率为1MHz,声压分别为1Mpa、3Mpa、5Mpa以及7Mpa分别辐照3分钟,聚焦面积1.1mm×5mm,空占比为25%,对照组置于同样治疗条件下,但未用超声辐照。用胎盘蓝染色测定细胞存活率；用扫描电镜(Scanning electron microscope, SEM)观察细胞形态学变化；活细胞共聚焦显微镜(disk spining unit, DSU)观察治疗后细胞迁移能力变化。细胞接种于96孔板内,紫杉醇、秋水仙碱不同浓度梯度下分四组(对照组,脉冲式海伏热疗组,药物组,脉冲式海伏热疗加药物组),5Mpa分别辐照3分钟治疗后24小时MTT法测定细胞存活率,评价其疗效。 MDA-MB-231细胞、MIA-Paca2细胞、U87细胞、SAOS-2细胞接种于8孔腔室玻片内,探头频率为1MHz,声压分别为1Mpa、3Mpa、5Mpa以及7Mpa分别辐照3分钟,聚焦面积1.1mm×5mm,空占比为25%,对照组置于同样治疗条件下,但未用超声辐照,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架改变。结果 1、pHIFU对乳腺癌细胞增殖和存活的影响与pHIFU的声压强度成正相关。其细胞存活率在不同声压治疗后分别为对照组为93.7%±4.15;1MHz:90.17%±9.79;3MHz为：85.0%±6.84;5MHz为：76.2%±3.67和7MHz为61.65%±0.2,说明在一定的时间下,其声压强度越大,生物学效应越明显,细胞死亡率也相应增加。 2、SEM示细胞形态学与超声声压强度呈正相关,随着超声声压的加大,细胞表面的绒毛呈现变稀、变粗、变短,甚至消失,表面出现较大的孔。 3、激光共聚焦显微镜示随着超声声压的加大,细胞内微管、微丝呈现增粗、靠边现象,细胞形态发生改变。 4、活细胞共聚焦成像系统(DSU)显示超声辐照后细胞活动能力明显降低。 5、在常温条件下超声辐照治疗3分钟后24小时,紫杉醇和秋水仙碱单药组与单1MHz pHIFU及药加1MHz超声辐照组相比对MDA-MB-231细胞的抑制率无明显差异,p值0.05；单药组和5MHz单超声辐照组及药加1MHz超声辐照组相比无统计学意义,p值0.05；药物加超声辐照组(5Mpa)和对照组相比具有显著性差异,其中PTX和PTX加pHIFU组p值0.001；COL和COL加pHIFU组p值0.01。结论 pHIFU可以增加细胞膜的通透性,降低细胞的迁移能力和增殖能力,可以作为药物或载体控释手段定位增加病变部位温度,而正常组织不会受到损伤,从而增加化疗药物敏感性,抑制肿瘤转移能力,为后续进一步体内实验提供方法学基础,为进一步研制具有自主知识产权的超声热疗设备提供其生物学效应实验研究基础。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R735.37

【参考文献】