鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用

发布时间：2019-08-04 12:39

【摘要】：构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库。以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性。以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性。经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上。经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因。电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×10~8。随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性。以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强。
【图文】：

Γ嘹晒┖笮鈃匝槭褂谩Ｓ捎冢塇A容易被自然环境中无处不在的ＲNAase降解，所以在提取和上样检测过程中要严格进行ＲNAase酶消解处理。本试验中提取的总ＲNA也有部分降解的痕迹，可能是电泳上样过程中被空气中的ＲNAase降解了，所以电泳检测过程中还需对环境和容器进行更为严格的酶失活处理。2．2重链基因和轻链基因扩增及ScFv基因拼接对重链基因和轻链基因进行扩增，先分别添加Linker序列，最后通过SOE-PCＲ将重链基因和轻链基因拼接为完整的ScFv基因，试验效果分别见图2、图3和图4。从图2、图3和图4中可以看出，，各图1鼠脾脏细胞总ＲNAFig．1TotalＲNAextractionfromspleencellsofmousePCＲ产物(重链基因约340bp，轻链基因约320bp，重链-Linker基因约440bp，Linker-轻链基因约420bp，ScFv基因约750bp)经DNA电泳检测，均含有清晰的目的基因片段，表明各PCＲ试验都达到了预期效果，目的基因扩增成功。2．3E．coliTG1电转感受态制备取1μlDNA浓度为0.1μg/μl的pCANTAB-5E噬菌粒载体，将其电转化到制备的E．coliTG1感受态细胞中，按公式(1)算得电转化效率为6．76×109，转化效率达到高效电转要求。徐重新等:鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用213

M:DNAmarker;1、3:轻链基因VL;2:重链基因VH。图2重链基因、轻链基因PCＲ扩增Fig．2PCＲamplificationofVHandVLM:DNAmarker;1、3:Linker-VL;2:VH-Linker。图3重链基因和轻链基因添加Linker基因PCＲ扩增Fig．3PCＲamplificationofVHandVLaddedLinkergeneM:DNAmarker;1、2:ScFv基因。图4ScFv基因PCＲ扩增Fig．4PCＲamplificationofScFvgene2．4噬菌体单链抗体展示库构建pCANTAB-5E噬菌粒载体提取并纯化后，分别以NotI酶、SfiI酶进行单酶切，以NotI酶和SfiI酶进行双酶切，经DNA电泳跑胶(图5)后，发现3种酶切方式处理的质粒载体条带均比未经过酶切处理的质粒大，表明在购买的噬菌粒载体中存在NotI酶和SfiI酶的酶切位点，且酶具有活性。将拼接好并且添加酶切位点基因扩增的ScFv基因和pCANT-AB-5E噬菌粒载体酶切、酶连后，电转导入到E．coliTG1电转感受态细胞中，经系列梯度稀释后涂板(图6)。计算获得初级噬菌体展示库库容量为3．67×108，随机挑取12个单克隆菌种进行PCＲ(图7)和测序验证(表2)，发现所有供测菌种中均含有目的基因大小片段(约900bp，含克隆位点前后约150bp通用序列)，经序列比对分析，证实均为小鼠抗体基因，且这些单克隆菌中ScFv基因的重链可变区基因、轻链可变区基因均存在或多或少差异。由此说明，试验中构建的鼠源噬菌体展示库库容量较大，多样性较丰富，初步确定达到预期试验目标。M:DNAmarker;1:pCANTAB-5E;2:pCANTAB-5E(经NotI酶切);3:pCANTAB-5E(经SfiI酶切);4:pCANTAB-5E(经NotI、SfiI双酶切)。图5pCANTAB-5E噬菌粒载体酶切验证Fig．5TherestrictionenzymecuttingofpCANTAB-5EphagevectorA:原液(100μl);B:稀释比例1×104(100μl);C:稀释比例1×105(100μl);D:稀释比例1×106(100μ
【作者单位】： 江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金项目(31630061、31371778) 省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室自主研究课题(49114063201604、49114063201608) 江苏省农业科学院院基金项目(6111676)
【分类号】：Q78

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本文编号：2522940