短裸甲藻毒素-2适配子的制备及在检测中的初步应用

发布时间：2019-12-01 11:46

【摘要】：短裸甲藻毒素-2（BTX-2）是一种从短裸甲藻中分离出来的聚醚类脂溶性贝类毒素，属于海洋神经性贝类毒素（NSP），主要来源于赤潮爆发中的有毒藻类，，这些有毒藻源通过食物链使毒素在贝类等水产品中蓄积，人误食了被短裸甲藻毒素污染的贝类、蟹类等水产品之后，会引起恶心呕吐、呼吸性窘迫、共济失调、局部肢体麻痹、口齿不清等症状，其原因主要是由于NSP引起了细胞内去极化作用。近年来，环境污染严重导致有害赤潮频繁发生，由于误食被NSP污染的贝类而导致食物中毒的事件时有报道。这不仅给水产养殖和加工造成巨大的经济损失，还给人类的身体健康带来了严重的威胁。为了保证公众远离毒素隐患和保障水产养殖业的发展，加强对BTX-2的检测和监管工作成为解决这一问题的有效途径。目前，用于BTX-2检测的方法主要有小鼠生物法、高效液相色谱法、受体结合分析法、放射免疫分析法等。这些方法都存在各自的优缺点，其不足之处是需要专业人员操作、昂贵的仪器设备、灵敏度低、涉及动物福利等。为解决上述问题，寻求一种可以快速准确方便检测BTX-2的方法具有重要意义。在快速免疫学检测方法中可选择的检测探针除了常用的抗体外，还有被称之为“化学抗体”的适配子。为了获得BTX特异、灵敏的检测探针，开发快速免疫学检测方法，本研究利用SELEX技术，筛选BTX-2特异性结合的高亲和力适配子，并以此作为检测探针，建立ELISA检测方法。采用混合酸酐法合成BTX-2与卵清白蛋白（OVA）和牛血清白蛋白（BSA）偶联物，作为筛选的靶标。设计并合成总长为85个核苷酸的单链随机寡核苷酸文库，其中序列两端分别为含有22个和23个核苷酸的固定序列用于设计合成引物，中间为含有40个碱基的随机序列，其中一条引物进行生物素标记，用于次级文库的扩增和亲和力测定。将靶标固定在微孔板中，利用SELEX技术进行核酸适配子的筛选，PCR进行文库扩增，琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证，经过12轮的反复筛选和富集过程，得到与BTX-2具有高亲和力的富集文库，经连接、转化、克隆、测序，利用DNAMAN和RNAstructure对所得序列进行一级结构的同源性分析和二级结构的预测分析。获得候选序列，通过间接ELISA进行亲和力和特异性检测，以筛选获得的适配子B5建立间接竞争ELISA方法，并对条件进行优化，获得标准曲线线性回归方程为y=-33.219x+80.994，相关系数为R2=0.9875，线性检测范围为1.07-68.57ng/mL，最低检测限为0.835ng/mL。以适配子为检测探针的竞争ELISA方法的建立为开发具有自主知识产权的海产品BTX的快速检测提供备选方法，为开发快速检测试剂盒提供实验基础，BTX快速检测方法的研究对保障海产品食用安全具有重要的意义。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S917.3

【参考文献】