南极微生物SOD基因克隆与表达及发酵优化的研究

发布时间：2017-08-10 20:25

  本文关键词：南极微生物SOD基因克隆与表达及发酵优化的研究

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【摘要】：南极具有独特的地理及气候特征,生存在其中的微生物,在长期的进化过程中,形成了极为独特的基因资源、遗传背景及新的代谢特征。南极微生物适应极端环境的机理,挖掘和开发其特殊功能基因是极端环境微生物领域研究的热点。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是抗氧化系统中的关键酶,它可以清除对生物体有害的超氧阴离子自由基(O2.-),维持生物体内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的产生与消除的动态平衡,从而防护自由基对机体的损伤,保证生物在氧胁迫环境下能够正常生长,因此,SOD在生物抗逆适应机制中扮演重要作用。本文从南极微生物Pseudoalteromonas sp.中利用简并引物通过PCR扩增筛选出一株含SOD的菌株P.sp.ANT506。将该目的基因(命名为Ps SOD)与p MD18-T载体连接,转入宿主菌E.coli DH5α,通过PCR扩增及酶切验证筛选阳性克隆。对阳性克隆菌进行序列测定,获得基因序列并利用生物信息学分析该Ps SOD的基本特性。分析表明,该Ps SOD基因具有完整的开放阅读框,大小为582bp,可编码一个含193aa的蛋白质。对Ps SOD推测的蛋白进行理化特性分析,结果表明,该蛋白预计分子量(MW)为21.4k Da,等电点(p I)为5.09,是一种亲水蛋白;蛋白结构预测显示,该蛋白由8个α-螺旋、3个β-折叠及无规卷曲组成;蛋白保守结构、SOD氨基酸序列的多序列比对与分析显示Ps SOD蛋白属于Mn/Fe SOD家族,保守区域氨基酸残基为WEHAYY。该蛋白与Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 Fe-SOD的蛋白序列相似度最高,达97.9%;进一步分析表明该Ps SOD蛋白为Fe-SOD,与金属离子结合的氨基酸为His18、His74、His167和Asp162。将Ps SOD基因与p ET-28a(+)连接,并将其转入表达宿主菌E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌(命名为p ET-SOD),利用IPTG和降低培养温度(28℃)方法诱导Ps SOD基因的异源表达。利用Ni-NTA纯化重组蛋白(r Ps SOD)并利用SDSPAGE鉴定。结果显示r Ps SOD大约为27k Da,其纯化倍数达12.6倍,回收率22.9%,纯化后的Ps SOD蛋白活性为587.4U/mg。r Ps SOD酶学特性研究表明,该酶的最适温度为30℃,最适p H为8.0;在0℃可以检测到最大酶活性的13.9%,相比其它金属酶,r Ps SOD具有低温催化活性和热不稳定性,为一种适冷酶。r Ps SOD经2.5M Na Cl预处理后检测到保持最大活性的62.4%,表明该蛋白具有一定的盐胁迫耐受能力。r Ps SOD具有其酶学独特性,可能与南极海冰低温和高盐的环境有关。利用Design-expert对p ET-SOD发酵表达r Ps SOD的培养基组分进行了研究,结果表明,乳糖、胰蛋白胨和吐温-80是影响微生物生长和r Ps SOD活性的主要因子。本文构建了关于r Ps SOD活性的二次多元回归模型,确定并验证了r Ps SOD活性最高时的发酵条件:0.047%吐温-80,6.16g/L胰蛋白胨,11.38g/L乳糖,5g/L酵母粉,10g/L Na Cl,p H7.5,这将为SOD重组菌的大规模发酵提供重要参数。本论文通过对南极微生物中SOD的基因克隆、表达、酶学特性以及重组菌发酵工艺的系统研究,获得了具有自主知识产权的抗逆基因资源,这为南极微生物来源的适冷酶的开发与利用提供了理论依据。
【关键词】：南极微生物 SOD 适冷酶 克隆 表达 优化
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q93;TQ925
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 绪论10-22
• 1.1 课题背景10
• 1.2 SOD的研究进展10-19
• 1.2.1 SOD的基本概念10-11
• 1.2.2 SOD的种类和分布11-13
• 1.2.3 SOD的理化性质13-15
• 1.2.4 SOD的催化机制15-16
• 1.2.5 SOD的作用及应用现状16-18
• 1.2.6 SOD的克隆与表达等研究18-19
• 1.3 两极微生物的研究价值19
• 1.4 课题来源和研究的目的意义及内容19-22
• 1.4.1 课题来源19-20
• 1.4.2 课题研究的目的及意义20
• 1.4.3 课题研究的主要内容20-22
• 第2章 南极微生物SOD的克隆及生物信息学分析22-37
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 菌株22
• 2.1.2 培养基22
• 2.1.3 试剂22-23
• 2.2 方法23-28
• 2.2.1 含SOD基因海冰细菌的筛选23-25
• 2.2.2 PsSOD基因T-A克隆与生物信息学分析25-28
• 2.3 结果与讨论28-36
• 2.3.1 菌株的筛选28-29
• 2.3.2 PsSOD的T-A克隆29-30
• 2.3.3 PsSOD基因的测序及其分析30-36
• 2.4 本章小结36-37
• 第3章 PsSOD基因的表达和酶学性质测定37-56
• 3.1 材料37-38
• 3.1.1 菌株和质粒37
• 3.1.2 试剂及配制37-38
• 3.2 方法38-45
• 3.2.1 表达菌株pET-SOD的构建39-41
• 3.2.2 pET-SOD的异源表达及纯化41-44
• 3.2.3 rPsSOD 蛋白的性质测定44-45
• 3.3 结果与讨论45-55
• 3.3.1 表达菌株pET-SOD的构建46-48
• 3.3.2 rPsSOD的表达及纯化48-51
• 3.3.3 rPsSOD的性质研究51-55
• 3.4 本章小结55-56
• 第4章 重组pET-SOD大肠杆菌培养基组分的发酵优化56-67
• 4.1 材料56-57
• 4.1.1 实验菌株56
• 4.1.2 试剂及培养基56-57
• 4.2 方法57-59
• 4.2.1 菌株的活化及发酵57
• 4.2.2 rPsSOD酶液的制备及活性测定57
• 4.2.3 发酵培养基重要因子的筛选57-58
• 4.2.4 爬坡实验58
• 4.2.5 Box-Behnken Design最佳发酵培养基组分实验设计58-59
• 4.2.6 验证实验59
• 4.3 结果与讨论59-66
• 4.3.1 发酵培养基重要因子的筛选59-61
• 4.3.2 爬坡实验61-62
• 4.3.3 Box-Behnken Design最佳发酵培养基组分实验设计62-65
• 4.3.4 验证实验65-66
• 4.4 本章小结66-67
• 结论67-69
• 参考文献69-78
• 攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果78-80
• 致谢80

【参考文献】

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本文编号：652518