农杆菌介导抗菌肽Rev4基因的紫花苜蓿遗传转化体系的建立

发布时间：2017-08-22 04:46

  本文关键词：农杆菌介导抗菌肽Rev4基因的紫花苜蓿遗传转化体系的建立

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【摘要】：紫花苜蓿(Medicago.Sativa.L)以“牧草之王”著称,是世界上分布最广的优良牧草。长期以来,人们围绕经济有效地提高紫花苜蓿产量和质量两大目标进行了不懈的努力。传统育种方法时间长、成本高且可利用的种质资源有限。植物基因工程更具有科学性和准确性。农杆菌介导的遗传转化法是目前研究最多、使用频率最高的方法之一。Indolicidin是一个13残基酰胺肽(IL-PWKWPWWPWRR-NH2),最初分离自牛嗜中性粒细胞的胞浆小颗粒,具有广谱抗细菌活性和抗病毒活性。抗菌肽Rev4是根据Indolicidin设计的反向类似物。本实验以紫花苜蓿种子为外植体,利用根癌农杆菌A.GV3850介导的种子整体侵染法进行遗传转化。首先将侵染后的紫花苜蓿种子经卡那霉素75mg/L(Kan75)压力筛选45 d左右,获得68株具有卡那抗性的苜蓿植株。提取抗性植株的基因组,并对其进行PCR扩增分析,其中有40株抗性植株的PCR检测为阳性,将PCR产物回收后,由北京华大基因有限公司进行序列测定。将测序成功的结果在美国国家生物技术信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站中进行序列对比与分析,我们利用Nucleotide Blast,成功鉴定13株转Rev4基因的苜蓿植株。以外施浓度为8mmol/L的水杨酸诱导Rev4基因表达,通过半定量RT-PCR对转化植株进行基因表达分析,确定抗菌肽Rev4基因在转化植株中成功表达。本研究利用根癌农杆菌介导的紫花苜蓿种子整体侵染法,成功地将抗菌肽Rev4基因转入紫花苜蓿,获得13株转基因株系,其中10株成功表达。该整体侵染法是本实验室具有自主知识产权的专利技术,具有转化率高、实验周期短、实验工作量少等优点。转抗菌肽苜蓿将大大提高苜蓿抗病性、抗虫性以及产量,同时在动物饲料工业中将具有巨大的潜力与优势,转抗菌肽Rev4的紫花苜蓿作为饲料可清除动物体内有害病毒、细菌及真菌,显著降低肠道疾病发生,提高牲畜的抗病性以及提高肉质。抗菌肽是非专一的免疫应答物质,因此,抗菌肽将极大地减少产生耐药性的可能。转抗菌肽苜蓿可发展为绿色养殖专用饲料,这不仅具有重大的生态效益,同时具有巨大的经济效益和社会效益。
【关键词】：紫花苜蓿 整体侵染法 抗菌肽 分子鉴定
【学位授予单位】：吉林师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S541.9
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 文献综述10-21
• 1.1 植物遗传转化研究进展10-13
• 1.1.1 植物遗传转化机制10
• 1.1.2 植物遗传转化方法10-13
• 1.2 苜蓿遗传转化研究进展13-16
• 1.2.1 苜蓿概述13-14
• 1.2.2 农杆菌介导的苜蓿遗传转化机理14-15
• 1.2.3 农杆菌介导的苜蓿遗传转化的影响因素15-16
• 1.3 抗菌肽研究现状16-21
• 1.3.1 抗菌肽简介16-17
• 1.3.2 抗菌肽作用机制17-18
• 1.3.3 抗菌肽Rev4在植物遗传转化中的研究进展18-21
• 第二章 材料与方法21-26
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 菌种和质粒21
• 2.1.2 植物材料21
• 2.1.3 PCR扩增引物序列21
• 2.1.4 实验试剂21-22
• 2.1.5 主要仪器设备22
• 2.1.6 培养基配方22-23
• 2.2 方法23-26
• 2.2.1 紫花苜蓿整体转化法体系23-24
• 2.2.1.1 菌种活化23
• 2.2.1.2 苜蓿种子消毒23-24
• 2.2.1.3 侵染24
• 2.2.1.4 共培养24
• 2.2.1.5 抗性转化植株的获得24
• 2.2.2 转基因植株的分子鉴定24-26
• 2.2.2.1 总DNA的提取24
• 2.2.2.2 PCR扩增24
• 2.2.2.3 PCR产物的序列测定24-25
• 2.2.2.4 总RNA的提取25
• 2.2.2.5 RT-PCR25-26
• 第三章 结果与分析26-37
• 3.1 紫花苜蓿转抗菌肽Rev4体系的建立26-27
• 3.1.1 紫花苜蓿种子整体侵染法26
• 3.1.2 转抗菌肽基因抗性植株的获得26
• 3.1.3 抗性植株的移栽26-27
• 3.2 转基因植株的PCR鉴定27-28
• 3.2.1 紫花苜蓿基因组的提取27
• 3.2.2 抗菌肽基因的PCR鉴定27-28
• 3.3 PCR产物的序列测定3.4 转化植株的半定量RT-PCR鉴定28-34
• 3.4 转化植株的 RT-PCR 鉴定34-37
• 3.4.1 苜蓿总RNA提取34-35
• 3.4.2 RT-PCR分析35-37
• 第四章 讨论37-40
• 4.1 紫花苜蓿种子整体侵染法37
• 4.2 抗菌肽基因pKLP36-PcRIL PCR程序的优化37
• 4.3 PCR产物测序结果讨论37-38
• 4.4 苜蓿RNA提取方案的优化38-39
• 4.5 外源水杨酸诱导抗菌肽表达39-40
• 结论40-42
• 参考文献42-48
• 攻读硕士期间发表的主要科研成果48-50
• 后记50

【参考文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 徐建;根癌农杆菌介导的F3’5’H基因对菊花遗传转化的初步研究[D];西南大学;2007年

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本文编号：717144