羊种布鲁氏菌015株gmd、per和manb缺失株的构建及诊断抗原反应原性评价研究

发布时间：2017-08-29 17:01

  本文关键词：羊种布鲁氏菌015株gmd、per和manb缺失株的构建及诊断抗原反应原性评价研究

  更多相关文章： 布鲁氏菌 manb基因 per基因 gmd基因 同源重组 脂多糖 鉴别诊断

【摘要】：布鲁氏菌病是一种人畜共患疾病,对畜牧业和人类健康构成了巨大威胁,被列为B类传染病。目前还没有人用布病疫苗,主要是通过布鲁氏菌弱毒活疫苗接种动物来防控布病。目前大多数动物布病疫苗为光滑型的减毒活疫苗,毒副作用较大、无法区分自然感染和人工免疫等不足。布鲁氏菌的致病机制还不完全清楚。脂多糖(LPS)是布氏杆菌非常重要的毒力因子,具有较强的抗原性。根据现有的研究表明,LPS的完整性与其胞内存活、增殖和毒力等密切相关。gmd、per和manb都与光滑型布鲁氏菌的LPS的生物合成过程有关。这些基因的缺失可以导致光滑型布鲁氏菌变为粗糙型布鲁氏菌。目的:本研究通过同源重组缺失了羊种布鲁氏菌生物3型流行株015的gmd,per和manb基因,构建相应的粗糙型缺失株;并在小鼠巨噬细胞RAW264.7和昆明系小鼠体内初步评价其毒力致弱情况,检测了免疫小鼠血清中IgG和IFN-γ水平;同时分别表达了gmd,per和manb蛋白,Western blot验证其反应原性;旨在为研发能区分疫苗免疫和自然感染的羊种布鲁氏菌标记性疫苗提供基础材料。方法:本研究以羊种布鲁氏菌015为模板,分别克隆gmd,per和manb基因的上、下游同源臂,以枯草芽孢杆菌为模板克隆SacB基因,将克隆得到的序列连接到pMDS19-T载体上,采用双酶切法将上游同源臂、下游同源臂、SacB序列分别连到自杀载体pGEM-7Zf上,分别构建了同源重组自杀载体pGEM-7Zf-Δgmd-SacB(pgs),pGEM-7Zf-Δper SacB(pps)和pGEM-7Zf-Δmanb-SacB(pms),然后分别电转至羊种布鲁氏菌015感受态细胞中,通过多次筛选分别获得015Δgmd,015Δper和015Δmanb基因缺失株;对获得的缺失株进行PCR鉴定和遗传稳定性等检测。用稳定遗传的粗糙型缺失株分别侵染鼠源巨噬细胞RAW264.7和昆明系小鼠,通过载菌量(CFU)检测缺失株毒力致弱情况;通过间接ELISA方法检测了免疫小鼠血清中IgG和IFN-γ水平。此外,用PCR方法分别扩增gmd,per和manb基因,将测序正确的基因序列分别克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上,然后转化至大肠杆菌DE3(BL21)中诱导表达。建立稳定的表达gmd,per和manb蛋白的体系,用布鲁氏菌自然感染绵羊血清进行western blot检测,最终筛选出有鉴别诊断意义的抗原蛋白。结果:成功构建了遗传稳定的粗糙型羊种布鲁氏菌015Δgmd,015Δper,015Δmanb缺失株,在20代内没有发生回复突变;015Δgmd,015Δper和015Δmanb缺失株在细胞水平和小鼠体体内证实毒力都显著降低且具有较好的免疫原性;以布鲁氏菌自然感染羊血清证实gmd、manb和per蛋白反应原性良好,具有自然感染与候选疫苗免疫抗体区分的潜在价值。结论:构建的羊种布鲁氏菌015Δgmd、015Δper和015Δper缺失株与对应表达蛋白联合应用,有望研发具有自主知识产权的缺失候选疫苗及配套诊断方法。
【关键词】：布鲁氏菌 manb基因 per基因 gmd基因 同源重组 脂多糖 鉴别诊断
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.12
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 英文及字符缩略词表14-15
• 引言15-17
• 第一章 文献综述 布鲁氏菌概述17-35
• 1 布鲁氏菌的病原学特征17-19
• 1.1 布鲁氏菌分类17-18
• 1.2 形态及染色特性18
• 1.3 培养及抵抗力18-19
• 1.4 致病性19
• 2 布病疫情情况19-23
• 2.1 世界布病流行情况19-20
• 2.2 我国布病流行情况20
• 2.3 新疆布病流行情况20-21
• 2.4 布鲁氏菌病的防制21-22
• 2.5 鲁氏菌病根除计划22-23
• 3 布鲁氏菌病的诊断方法23-25
• 3.1 细菌培养法23
• 3.2 血清学技术23-24
• 3.2.1 凝集反应23-24
• 3.2.2 补体结合试验(CFT)24
• 3.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)24
• 3.3 聚合酶链反应(PCR)在布病检测中的应用24-25
• 3.3.1 PCR应用于布鲁氏菌抗原鉴定的研究24-25
• 3.3.2 PCR应用于布鲁氏菌种型的鉴定研究25
• 4 布鲁氏菌主要的毒力因子25-29
• 4.1 脂多糖及合成相关的毒力基因（manb、per和gmd）25-27
• 4.2 BvrR/BvrS双组分系统27
• 4.3 四型分泌系统(Type 4 secretion system,T4SS）27-28
• 4.4 密度感应系统(Quorum Sensing ,QS)28
• 4.5 其他毒力因子28-29
• 4.5.1 外膜蛋白(Major outer membrane proteins,OMPs )28
• 4.5.2 环β-1,2 葡聚糖(Cyclicβ-1,2-glucans,CβGs)28-29
• 4.5.3 应激反应蛋白29
• 5 布鲁氏菌病疫苗研究进展29-35
• 5.1 布鲁氏菌病主要的弱毒苗及灭活苗30-31
• 5.2 布鲁氏菌亚单位疫苗31-32
• 5.3 载体疫苗32-33
• 5.4 DNA疫苗33
• 5.5 布氏菌外膜囊泡疫苗33-35
• 第二章 试验研究35-71
• 实验一 羊种布鲁氏菌015株gmd、per、manb基因缺失株的构建35-53
• 摘要35-36
• 1 材料与方法36-44
• 1.1 材料36-37
• 1.1.1 菌株来源、载体36
• 1.1.2 主要试剂36
• 1.1.3 主要实验仪器36-37
• 1.1.4 培养基37
• 1.2 方法37-44
• 1.2.1 目的基因的PCR扩增37-38
• 1.2.2 目的基因回收38
• 1.2.3 目的基因与pMD19-T载体的连接38-39
• 1.2.4 连接产物的转化39-40
• 1.2.5 重组质粒的菌液PCR鉴定40
• 1.2.6 阳性单克隆的扩繁40
• 1.2.7 重组质粒的提取40
• 1.2.8 重组质粒的鉴定40
• 1.2.9 自杀载体的构建40-41
• 1.2.10 重组自杀载体的酶切鉴定41
• 1.2.11 测序41
• 1.2.12 重组自杀质粒pgs、pps、pms的电转41-42
• 1.2.13 同源重组子的筛选42-44
• 2 结果44-50
• 2.1 布鲁氏菌 015 Δgmd、Δper、Δmanb缺失株的构建44-48
• 2.1.1 同源重组质粒pgs、pps、pms的构建44-45
• 2.1.2 同源重组质粒pgs、pps、pms的酶切鉴定45-46
• 2.1.3 Δgmd、Δper、Δmanb的一次筛选46-47
• 2.1.4 Δgmd、Δper、Δmanb的二次筛选47-48
• 2.2 缺失株Δgmd、Δper、Δmanb的遗传稳定性检测48-50
• 3 讨论50-51
• 3.1 同源重组子的构建50-51
• 3.2 电转条件的优化51
• 3.3 无痕敲除构建突变株51
• 4 小结51-53
• 实验二 羊种布鲁氏菌 015Δmanb、Δper和Δgmd缺失株的毒力评价53-62
• 摘要53
• 1 材料与方法53-57
• 1.1 材料53-54
• 1.1.1 菌株来源53-54
• 1.1.2 实验细胞及动物54
• 1.1.3 主要试剂和仪器54
• 1.2 实验方法54-57
• 1.2.1 细胞培养液和PBS缓冲液的配制54
• 1.2.2 RAW264.7 细胞的培养54-55
• 1.2.3 细胞计数55
• 1.2.4 菌株的培养及计数55
• 1.2.5 Δmanb、Δper和Δgmd缺失株的毒力初步评价55-57
• 2 结果57-59
• 2.1 基因缺失对布鲁氏菌毒力的影响57-58
• 2.1.1 缺失株在小鼠巨噬细胞RAW264.7 内的增殖57
• 2.1.2 缺失株在小鼠体内的存活情况57-58
• 2.3 菌株诱导机体抗体水平差异(IgG)58-59
• 2.4 菌株诱导机体产生INF-γ的差异59
• 3 讨论59-61
• 3.1 缺失株毒力评价60
• 3.2 per、gmd和manb基因对免疫原性的影响60-61
• 4 小结61-62
• 实验三 布鲁氏菌gmd、per和manb基因的原核表达62-71
• 摘要62
• 1 材料与方法62-66
• 1.1 材料62-63
• 1.1.1 菌株与载体62-63
• 1.1.2 酶、主要试剂63
• 1.1.3 主要仪器63
• 1.2 方法63-66
• 1.2.1 gmd、per、manb基因的扩增63-64
• 1.2.2 gmd、per和manb基因的连接与转化64
• 1.2.3 重组质粒的酶切鉴定64
• 1.2.4 pET-28a-gmd、pET-28a-per和pET-28a-manb表达载体的构建64-65
• 1.2.5 gmd、per和manb蛋白的表达65
• 1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）65-66
• 1.2.7 Western blot分析66
• 2 结果66-69
• 2.1 目的基因的扩增66-67
• 2.2 重组表达质粒的构建及鉴定67-68
• 2.3 gmd、per和manb蛋白的表达68-69
• 2.4 Western blot验证蛋白的反应原性69
• 3 讨论69-70
• 4 小结70-71
• 参考文献71-79
• 致谢79-80
• 作者简介80
• 在学期间主要参与的研究项目80
• 在学期间发表的文章80-81
• 附件81

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本文编号：754393