米曲霉脯氨酰内肽酶在毕赤酵母中的表达、酶学特性及其应用研究

发布时间：2017-08-31 20:19

  本文关键词：米曲霉脯氨酰内肽酶在毕赤酵母中的表达、酶学特性及其应用研究

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【摘要】：脯氨酰内肽酶(Prolyl Endopeptidase,PEP)是一种能特异性水解小分子多肽中脯氨酸羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶,在食品、发酵、医药、啤酒生产等行业有着非常重要的作用。然而,目前脯氨酰内肽酶的蛋白表达量较低,不能适应大规模的工业化应用。本文在实验室前期开发获得具有自主知识产权的米曲霉脯氨酰内肽酶的基础上,利用融合表达实现该米曲霉脯氨酰内肽酶基因在毕赤酵母中的高效表达,并对融合蛋白进行分离纯化以及酶学性质测定,通过7 L发酵罐扩大培养进一步提高了米曲霉脯氨酰内肽酶的表达水平,并研究了该酶对啤酒酵液非生物稳定性的影响。主要研究成果如下:(1)以紫红色链霉菌磷脂酶PLA2,纤维素结构域(CBD),泛素相关的小标签调节器(SUMO),麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签,构建四种融合表达菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-SLMH,GS115/pPIC9K/pPICZαA-CLMH,GS115/pPIC9K/pPICZαA-MLMH,GS115/pPIC9K/pPICZαA-PLMH,连同出发菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-MOH,用荧光定量PCR方法鉴定目的基因拷贝数,分别筛选出5拷贝的阳性克隆菌株进行摇瓶发酵,比较它们在发酵过程中的菌体浓度,蛋白浓度及酶活。结果显示,相较于出发菌株,四种融合蛋白的酶活分别提高了2.7,3.8,4.9,7.4倍。借助western blot方法对五种菌株胞内胞外PEP蛋白进行了鉴定。同时,对出发菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-MOH和融合表达菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-PLMH在转录水平进行比较,结果表明在mRNA转录水平上,融合表达菌株是出发菌株的2.3倍。SDS-PAGE与质谱鉴定结果显示,脯氨酰内肽酶在分泌表达过程中,发生了蛋白的自切割效应。(2)研究了表达量最高的融合蛋白PLMH的酶学性质,并与初始蛋白MOH进行比较。经纯化后,酶学性质研究表明,PLMH及MOH最适温度均为40°C,温度稳定性方面,当温度低于30°C时,稳定性较好,当温度达到45°C时,剩余酶活几乎为零;PLMH与MOH两者最适pH均为5.5,pH稳定性方面,pH在5.0-8.0之间稳定性较好。此外,PLMH的Km,kcat,kcat/Km分别为0.23±0.01 mM,112.51±0.02 s-1,489.17s-1 mM-1,相比MOH,两者动力学参数较为相近。(3)将融合表达菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-PLMH进行7 L发酵罐高密度发酵,发酵条件为起始诱导OD600为110,甲醇诱导浓度1 g?L-1。诱导96 h时结束发酵。发酵结果显示,最高酶活出现在78 h,为960 U?L-1,最高蛋白浓度0.28 mg?mL-1,最高OD600660。(4)通过在啤酒后酵液中添加不同浓度的PLMH研究脯氨酰内肽酶对啤酒后酵液非生物稳定性的影响,与空白对照相比,脯氨酰内肽酶不仅能降低啤酒发酵液中敏感蛋白的含量,同时还能提高啤酒后酵液在贮存期间的非生物稳定性。
【关键词】：脯氨酰内肽酶 毕赤酵母 融合表达 酶学性质 应用
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q55
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 绪论7-13
• 1.1 立题意义7
• 1.2 国内外研究进展7-12
• 1.2.1 脯氨酰内肽酶简介7
• 1.2.2 脯氨酰内肽酶的应用7-9
• 1.2.3 脯氨酰内肽酶的表达9
• 1.2.4 米曲霉脯氨酰内肽酶的表达9
• 1.2.5 毕赤酵母表达系统概述9-10
• 1.2.6 提高外源蛋白表达量的策略10
• 1.2.7 融合表达10-12
• 1.3 本课题研究思路和内容12-13
• 1.3.1 课题研究思路12
• 1.3.2 课题研究内容12
• 1.3.3 课题来源12-13
• 第二章 实验材料与方法13-22
• 2.1 实验材料13-15
• 2.1.1 菌株与质粒13
• 2.1.2 培养基与溶液13-14
• 2.1.3 主要试剂及仪器14-15
• 2.2 实验方法15-22
• 2.2.1 重组PEP基因表达菌株的构建15-16
• 2.2.2 重组PEP表达菌株的构建16-17
• 2.2.3 重组阳性克隆菌株的筛选17
• 2.2.4 基因重组菌株的生长及表达17
• 2.2.5 脯氨酰内肽酶酶活力测定方法17-18
• 2.2.6 重组菌株脯氨酰内肽酶基因拷贝数的鉴定18
• 2.2.7 反转录法鉴定mRNA18-19
• 2.2.8 重组蛋白的鉴定19
• 2.2.9 重组蛋白的分离纯化及酶学性质测定19-20
• 2.2.10 重组菌株在 7 L发酵罐高密度发酵20-21
• 2.2.11 脯氨酰内肽酶对啤酒非生物稳定性的研究21-22
• 第三章 结果与讨论22-37
• 3.1 米曲霉脯氨酰内肽酶在毕赤酵母中的表达22-25
• 3.2 米曲霉脯氨酰内肽酶在毕赤酵母中的融合表达25-28
• 3.2.1 荧光定量PCR鉴定出发菌株及融合表达菌株的目的基因拷贝数26
• 3.2.2 融合表达菌株的摇瓶发酵26-28
• 3.2.3 融合蛋白western blot分析28
• 3.3 不同连接肽对以磷脂酶为融合标签的重组脯氨酸蛋白酶的影响28-29
• 3.4 融合蛋白转录水平分析29-30
• 3.5 米曲霉脯氨酰内肽酶酶学性质研究30-33
• 3.5.1 融合蛋白PLMH的MADLI-TOF-MS分析30-31
• 3.5.2 脯氨酰内肽酶酶学性质研究31-33
• 3.6 融合表达菌株毕赤酵母基因工程菌的 7 L发酵罐高密度培养33-35
• 3.7 脯氨酰内肽酶对啤酒非生物稳定性的应用研究35-37
• 3.7.1 不同加酶量对成品啤酒贮存期间的稳定性研究35
• 3.7.2 不同加酶量对啤酒发酵液中浑浊蛋白的影响35-37
• 主要结论与展望37-39
• 主要结论37-38
• 展望38-39
• 致谢39-40
• 参考文献40-44
• 附录：附表44-45
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文45

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本文编号：767701