脂肪酶产生菌F.Oxysporum_SHM的分离鉴定及其发酵条件优化

发布时间：2017-09-30 06:25

  本文关键词：脂肪酶产生菌F.Oxysporum_SHM的分离鉴定及其发酵条件优化

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【摘要】：脂肪酶是一种可以水解脂肪的酶类,催化脂肪水解为甘油和脂肪酸。动物、植物和微生物都可以分泌脂肪酶,其中微生物脂肪酶广泛应用于脂肪的生产工业、去污工业和食品工业等领域。国内外对脂肪酶研究涉及脂肪酶结构催化特性、高产菌株选育和发酵条件控制等方面。本研究通过筛选鉴定得到一株具有自主知识产权的脂肪酶生产菌株F.Oxysporum_SHM,并对其发酵条件和脂肪酶粗酶的酶学性质进行初步探讨。首先采用橄榄油为唯一碳源的培养基从油脂实验室空气、居民家灶台和食堂附近土壤中筛选可以利用油脂的微生物,经过初筛和复筛获得一株酶活力相对较高菌株Y18,通过形态学和分子生物学鉴定确定其属于丛梗孢科(Monilianceae)镰孢菌属(Fusarium LK)尖孢镰刀菌(Fusarium Oxysporum),初步命名为F.Oxysporum_SHM。然后对该菌株发酵条件进行优化。在选出适宜的基础培养基后,对油脂、碳源、氮源、KH2PO4、Mg SO4、p H和装液量等单因素进行优化,并利用响应面设计(CCD)确定了发酵最优条件,即:1%亚麻籽油、0.5 g/L Mg SO4?7H2O、2.0 g/L K2HPO4?3H2O、8.0 g/L蔗糖、30.0 g/L胰蛋白胨、p H8.0、装液量30.0 m L/250 m L。在此条件下,预测发酵产脂肪酶活力为5566.85 U/m L,实际测得发酵产酶活力为5216.23 U/m L,与模型预测接近。最后对F.Oxysporum_SHM脂肪酶粗酶的酶学性质进行初步探讨。通过硫酸铵盐析、透析除盐、Mono Q阴离子交换层析得到较纯的F.Oxysporum_SHM脂肪酶,与发酵液相比纯化了27.10倍。对透析除盐后冷冻干燥的脂肪酶粗酶进行酶学性质分析,该酶最适温度为40℃,并在45℃以下较稳定;该酶最适p H 9.0,在p H3.0~10.0范围内较稳定;Ca2+、Fe2+、Mn2+可以不同程度地提高脂肪酶活力,其中Fe2+作用显著,酶活力提高181%,Mg2+、Cu2+对酶活力有抑制作用,分别保留了83.82%和76.98%的残余酶活力;利用双导数法测定该脂肪酶水解p-NPP的Km为270.36 mg/L、Vmax为25.91 nmol/min·mg;通过与两种商品脂肪酶活力比较表明,F.Oxysporum_SHM脂肪酶活力较高,两种商品仅为其活力的6.2%和13.6%。
【关键词】：脂肪酶 尖孢镰刀菌 分离鉴定 发酵条件优化 阴离子交换层析
【学位授予单位】：上海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ925
【目录】：

• 摘要9-10
• ABSTRACT10-12
• 第1章 绪论12-21
• 1.1 脂肪酶简介12
• 1.2 脂肪酶结构12-13
• 1.3 脂肪酶催化特性和分类13-14
• 1.4 脂肪酶应用14-15
• 1.5 脂肪酶国内外研究进展15-20
• 1.5.1 脂肪酶结构与催化特性16
• 1.5.2 脂肪酶高产菌株选育16-17
• 1.5.3 脂肪酶发酵条件控制17-20
• 1.6 本课题研究的目的与意义20-21
• 第2章 脂肪酶产生菌F. Oxysporum_SHM的分离鉴定21-39
• 2.1 材料与试剂21-23
• 2.1.1 样品采集21
• 2.1.2 主要仪器及设备21-22
• 2.1.3 主要生化试剂22
• 2.1.4 培养基22-23
• 2.2 实验方法23-27
• 2.2.1 脂肪酶活力测定23-24
• 2.2.2 菌株筛选24-25
• 2.2.3 菌株形态学鉴定25
• 2.2.4 菌株分子生物学鉴定25-27
• 2.3 结果与讨论27-38
• 2.3.1 脂肪酶酶活力的测定27-29
• 2.3.2 脂肪酶产生菌株的富集和初筛29-30
• 2.3.3 脂肪酶产生菌株的复筛30-32
• 2.3.4 菌株形态学鉴定32-34
• 2.3.5 菌株分子生物学鉴定34-38
• 2.4 本章小结38-39
• 第3章 F. Oxysporum_SHM产脂肪酶发酵条件优化39-61
• 3.1 材料和试剂39-41
• 3.1.1 菌株39
• 3.1.2 主要仪器及设备39-40
• 3.1.3 主要生化试剂40
• 3.1.4 培养基40-41
• 3.2 实验方法41-44
• 3.2.1 培养方法41
• 3.2.2 脂肪酶酶活力测定41
• 3.2.3 菌体量测定41
• 3.2.4 发酵液中总糖含量测定41-42
• 3.2.5 发酵基础培养基选择42
• 3.2.6 单因素实验42
• 3.2.7 响应面分析42-43
• 3.2.8 生长曲线绘制43
• 3.2.9 SDS-PAGE凝胶电泳43-44
• 3.2.10 数据分析44
• 3.3 实验结果与讨论44-60
• 3.3.1 发酵基础培养基选择44-45
• 3.3.2 油脂对发酵产脂肪酶活力的影响45-46
• 3.3.3 碳源对发酵产脂肪酶活力的影响46-47
• 3.3.4 氮源对发酵产脂肪酶活力的影响47-50
• 3.3.5 磷酸二氢钾和硫酸镁对发酵产脂肪酶活力的影响50-51
• 3.3.6 pH对发酵产脂肪酶活力的影响51-52
• 3.3.7 装液量对发酵产脂肪酶活力的影响52-53
• 3.3.8 响应面设计（CCD）确定发酵条件的最优水平53-58
• 3.3.9 F. Oxysporum_SHM摇瓶发酵曲线58-60
• 3.4 本章小结60-61
• 第4章 F. Oxysporum_SHM脂肪酶酶学性质分析61-73
• 4.1 材料和试剂61-62
• 4.1.1 主要仪器及设备61-62
• 4.1.2 主要生化试剂62
• 4.2 实验方法62-65
• 4.2.1 发酵上清液的制备62
• 4.2.2 脂肪酶活力测定62
• 4.2.3 发酵液的(NH4)2SO4沉淀62-63
• 4.2.4 粗酶液透析除盐63
• 4.2.5 真空冷冻干燥制备粗酶粉63
• 4.2.6 粗酶的酶学性质分析63-64
• 4.2.7 阴离子交换层析纯化脂肪酶64
• 4.2.8 SDS-PAGE蛋白电泳分析64-65
• 4.2.9 蛋白浓度测定65
• 4.2.10 数据分析65
• 4.3 实验结果与讨论65-71
• 4.3.1 F. Oxysporum_SHM脂肪酶的纯化65-67
• 4.3.2 F. Oxysporum_SHM脂肪酶最适温度和温度稳定性67-68
• 4.3.3 F. Oxysporum_SHM脂肪酶最适pH和pH稳定性68-70
• 4.3.4 金属离子对F. Oxysporum_SHM脂肪酶活性影响70
• 4.3.5 F. Oxysporum_SHM脂肪酶米氏常数测定70-71
• 4.3.6 F. Oxysporum_SHM脂肪酶活性与商品酶活性比较71
• 4.4 本章小结71-73
• 参考文献73-84
• 作者在攻读硕士学位期间科研成果84-85
• 致谢85

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 纵伟;董海丽;;脂肪酶及其在食品工业中的应用[J];安徽农学通报;2007年15期

2 黄瑛;尹利;闫云君;;双水相萃取法分离纯化洋葱假单胞菌G-63脂肪酶[J];现代化工;2007年S2期

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本文编号：946657