高分辨率溶解曲线法检测食品中致病菌的方法研究

发布时间：2018-03-09 01:15

  本文选题：HRM　切入点：tHDA　出处：《华南理工大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：当今食源性疾病已成为一个全球关注的食品卫生问题,水产品、肉制品和奶制品等食物中经常同时发现沙门氏菌(Salmonella)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等食源性致病菌,单独检测一种致病菌的方法已经无法满足现今社会对致病菌检测的高效率要求。目前国内常用的食源性致病菌检测法——传统细菌培养法存在操作繁琐、检测时间较长,灵敏度较低等不足。为建立一种同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌三种致病菌的快速、简便、高通量、低成本的检测体系,本研究分别以invA、hly和Sa442基因为沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的靶基因,结合特异性引物,创新性地建立HRM-real time PCR和HRM-tHDA检测体系。 (1)HRM-real time PCR体系。建立单重HRM-real time PCR体系,在其基础上建立多重HRM-real time PCR体系,并对引物浓度、模板浓度、熔解速率等因素进行优化,最终确定多重IRM-real time PCR体系(25μL)为：10×buffer2.5μL,Taq多聚酶(5U/μL)0.5μL,Taq多聚酶抗体(5U/μL)0.5μL,dNTP(10mmol/L)2.5μL,MgCl2(25mmol/L)3.0μL,上/下游引物(10μmol/L)0.5μL,模板DNA(0.5μmol/L)2.0μL,EvaGreen (20mg/mL)1.25μL,BSA(20mg/mL)0.2μL,去核酸水补齐至25μL。反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s,60℃退火45s,40个循环。PCR产物进行高分辨率熔解曲线分析,熔解程序为：95℃2min,60℃2min:60℃1s,然后升温至95℃(熔解速率为0.2℃C/s),最后50℃冷却。 对多重HRM-real time PCR体系进行特异性、敏感性及重复性评价,进而将该体系应用在人工染菌样本及自然染菌样本的检测中。特异性试验表明,参与试验的90株目标菌株检测结果均为阳性,沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的Tm值分别为79.4±0.14℃,82.5±0.15℃和77.4±0.14℃；44株非目标菌株均为阴性,说明该体系具有较高的特异性。灵敏度试验表明,该体系检测沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌单一致病菌的灵敏度均为102CFU/mL；同时检测三种目标菌种的灵敏度为：102、102和103CFU/mL。稳定性实验结果为：该体系检测三种目标菌种的组内变异系数(CV值)均低于2.17%,组间CV值均低于3.93%,提示该体系具有较高的稳定性。对50份人工染菌样本中三种目标菌的检测限均为5CFU/25g食品,相比国标法具有较高的准确性及灵敏度。对120份天然染菌猪肉样本分别用HRM-real time PCR、测序法和国标法三种方法检测沙门氏菌,阳性检出率分别为25.00%,25.00%和24.17%,相比国标法具有较高的阳性检出率；三种方法检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的阳性检出率则相同。 (2) HRM-tHDA体系。研发出简便高效的Tte-uvrD粗酶蛋白制备法：以腾冲嗜热厌氧菌基因组DNA为模板,克隆表达出Tte-uvrD,再经超声破碎、硫酸铵沉淀、透析除盐、冻干、复溶于酶贮存液中得到粗酶液。粗酶液具有较高的tHDA检测灵敏度和反应稳定性。 建立基于Tte-uvrD粗酶液的单重HRM-tHDA反应体系,体系(50μL)为：Tte-UvrD粗酶液(160ng/μL)3.5μL,10×Annealing buffer Ⅱ5.0μL,dNTP Mixture(10mmol/L each)3.5μL,NaCl(500mmol/L)4.0μL, MgSO4(100mmol/L)2.0μL,上/下游引物(10μmol/L)1.0μL,模板DNA (105CFU/mL)2.0μL,20x EvaGreen0.5μL, ddH2O补齐至50.0μL反应程序为：63℃5s,62℃55s,进行40个循环；熔解程序为：95℃2min,60℃2min；60℃1s,然后升温至95℃(熔解速率为0.2℃/s),最后50℃冷却。 对HRM-tHDA单重反应体系进行特异性、灵敏度及稳定性评估,进而将该体系应用在人工染菌样本及自然染菌样本的检测中。特异性实验结果表明：在参与试验的30株目标菌株和30株非目标菌株中,只有目标检测菌种检测结果为阳性,非目标菌种均为阴性,提示该体系具有较高的特异性。沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌目的扩增产物的Tm值分别为79.4±0.13℃,82.4±0.11℃和77.5±0.16℃。灵敏度实验表明,该体系分别检测三种目标菌的最低检出限均为102CFU/mL。重复性实验表明,三种目标菌实验内CV值均低于2.61%,实验间CV值均低于2.97%,提示该体系具有较高的重复性。该体系对人工染菌样品中三种目标菌的单重检测的灵敏度均能达到5CFU/25g。对50份市售猪肉样本的检测试验结果表明：单重IRM-tHDA法可达到和国标法相等的阳性检出率。 本研究建立并优化了HRM-real time PCR和HRM-tHDA两种致病菌检测体系,体系特异性好、灵敏度高、重复性好,能应用于食品样本的检测,具有快速、简便、成本低廉的优点和较强的实际应用价值,其中HRM-real time PCR体系已应用于致病菌多重检测中。新的检测体系的建立,对于建立完善的食品安全保障体系,确保食品供应链的安全,预防和控制食源性致病菌,保障人类健康具有重大的实际意义。
[Abstract]:The food borne diseases have become a global concern of food hygiene, aquatic products, meat and dairy products and other foods are often found Salmonella (Salmonella), List Rand (Listeria monocytogenes) Listeria and Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) and other food borne pathogens, a method of separate detection of pathogenic bacteria has been unable to meet the social requirements for pathogen detection efficiency. The common foodborne pathogen detection method has a complicated operation, the traditional bacterial culture method, the detection time is longer, the sensitivity is low. In order to establish a simultaneous detection of Salmonella, Listeria Lester bacteria and Staphylococcus aureus three kinds of pathogenic bacteria fast, convenient, high-throughput, low cost detection system, this study respectively by invA, hly and Sa442 genes for Salmonella, Listeria and Staphylococcus Dan Zengli The target gene of cocci, combined with specific primers, innovatively established the HRM-real time PCR and HRM-tHDA detection system.
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本文编号：1586361