前列腺癌转移相关基因的生物信息学分析及功能预测

发布时间：2016-10-26 14:02

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南方医科大学２０１１级博士学位论文

前列腺癌转移相关基因的生物信息学分析及功能预测ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆ

ＰｒｏｓｔａｔｅＣａｎｃｅｒＭｅｔａｓｔａｓｉｓＲｅｌａｔｅｄＧｅｎｅｓ

课题来源：自选

学位申请人

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培

所师业李铁求毛向明教授外科学（泌尿外科）临床型博士姓名名称型养养在类层次院学第一临床医学院

黄健教授

丘少鹏教授答辩委员会主席答辩委员会委员

周芳坚教授

郑少斌教授

齐桓副教授

论文评阅人邓春华教授

韦安阳教授

谭万龙教授

２０１４年３月２０日广州

博士学位论文

前列腺癌转移相关基因的生物信息学分析

及功能预测

博士研究生：李铁求

指导老师：毛向明教授

摘要

前列腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅｃａｌｌｃｅｒ，ＰＣａ）是危害男性健康最常见的肿瘤之一，其发病率在美国居男性恶性肿瘤之首，占男性死亡原因的第二位，在中国前列腺癌的发病率远低于西方国家，然而，近２０年来，我国前列腺癌的发病率也呈现逐年上升趋势，并且发病年龄也日趋年轻化，可能与生活方式、寿命延长、人口老龄化以及诊断技术的提高有关。前列腺癌多发生在外周带，早期无特异性症状，病变发展到晚期，则多发生局部浸润或远处转移，盆腔淋巴结是ＰＣａ最早转移部位，而骨骼是常见转移部位。局限性的ＰＣａ患者５年生存率几乎１００％，而发生远处转移的ＰＣａ患者５年生存率下降到约为２９％，前列腺癌患者一旦发生转移不仅预后差，而且严重影响其生活质量。骨转移是前列腺癌重要的临床特征和主要致死原因，美国死于前列腺癌的患者中，８０％以上合并骨转移。前列腺癌骨转移可导致患者发生骨痛、病理性骨折、脊髓压迫、活动受限等骨相关事件（ｓｋｅｌｅｔａｌｒｅｌａｔｅｄｅｖｅｎｔｓ，ＳＩ迮ｓ）。前列腺癌骨转移诊断主要依赖Ｘ片、ＣＴ以及Ｍ对等影像学检查，骨扫描是前列腺癌转移诊断的最重要的诊断方法，骨扫描通过放射性追踪剂显示区分正常和异常骨活动，当怀疑骨转移、前列腺癌患者出现临床症状或者治疗过程中ＰＳＡ升高应考虑行骨扫描进一步检查。雄激素与正常前列腺细胞与前列腺癌细胞的生长存在密切关系，目前，内分泌治疗目前仍是转移性前列腺的最有效治疗手段，其目的在于减少或消除雄激素对前列腺生长的促进作用，从而缓解转移性前列腺癌的症状。内分泌治疗通常包括手术去势与药物

中文摘要

去势。药物去势通过使用雌激素类药物、抗雄激素类药物或黄体素释放激素类似物等药物以阻断雄激素与雄激素受体的结合或减少体内雄激素的产生。转移性前列腺癌患者的内分泌治疗属于姑息治疗。其治疗目的主要是在于减少或消除雄激素对前列腺生长的促进作用，控制前列腺癌的进展，减少相关症状，提高生活质量，目前对于临床医师来讲其治疗仍旧是巨大的挑战。前列腺癌转移是一系列复杂而有序的过程，其临床表现及转归也不尽相同，对转移机制的研究尚待继续深入。与此同时，遗传学及分子生物学研究正努力寻找敏感、有效的判断肿瘤发生、发展及转移的标记物，用于临床指导治疗方案的选择，为前列腺癌治疗的发展奠定坚实的基础。

前列腺癌转移与其它恶性肿瘤一样是多基因、多因子相互作用和相互影响的复杂过程，也是肿瘤防治工作中面临的难题。转移包括肿瘤细胞的播撒入血液和淋巴系统、粘附管壁、维持生长、分泌生长因子和细胞因子、同转移部位微环境之间的分子相互作用等多个步骤。只有有效控制、阻断肿瘤转移才可能实现肿瘤的治愈。肿瘤在演进过程中，一些肿瘤细胞具有了侵袭和转移能力，而这种转移表型的获得在很大程度上是由于肿瘤细胞内基因发生异常改变引起的。因此，从分子水平揭示肿瘤转移的本质，研究肿瘤转移相关基因成为肿瘤转移研究的热点。近年发展起来的基因芯片技术和生物信息学显示了其在分析疾病方面的优越性。

基因芯片是生命科学领域的一项重要的技术平台，是筛选差异表达相关基因的有效手段，具有高通量和快速测量等优点。在基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等领域得到广泛的应用。但得到了基因芯片结果，并不等于获得了信息和知识，如何解读芯片上成千上万个基因点的杂交信息，将无机的信息数据与有机的生命活动联系起来，阐释生命特征和规律以及基因的功能，是基因芯片后期数据挖掘的一个重要方向。高通量微阵列杂交技术和测序技术的快速发展，产生了大量的基因数据，生物信息迅速膨胀成为数据的海洋。为适应这种高通量基因表达数据的不断增长和人们共享数据的需要，各种数据库应运而生，ＩＩ

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其中，美国国立生物信息技术中心（Ｎａｔｉｏ砌ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆ０衄ａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）的高通量基因表达数据库（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ０Ｉｎｌｌｉｂｕｓ，ＧＥＯ）是世界上最大的储存高通量分子丰度数据的公共数据库，用户可以提交、储存和检索多种形式的数据并免费使用。ＧＥＯ数据库操作简单，数据全面，免费共享的优势为后期数据挖掘和信息推广提供了良好的平台。

生物信息学是二十世纪８０年代末随着基因组测序数据迅猛增加而逐渐形成的一门交叉学科。随着生物学和医学的迅速发展，特别是人类基因组计划的顺利推进，产生了海量的生物学数据，这些数据具有丰富的内涵，隐藏着丰富的生物学知识。充分利用这些数据，通过数据分析、处理，揭示这些数据的内涵，得到对人类有用的信息，将是生物学家和数学家所面临的一个严峻的挑战，生物信息学正是为迎接这种挑战而发展起来的一门交叉学科。具体地说，生物信息学是现代生物学与医学科学和信息科学、计算机科学、生物统计学、数学等学科相互渗透并高度交叉形成的一门新兴前沿学科，它以获取、加工、储存、管理、检索、分配、分析和释读生物学实验信息为手段，综合运用数学、计算机科学和生物学工具，以达到理解数据中所蕴含的生物学含义为目的。目前，生物信息学已广泛地渗透到生命科学的各个研究领域中，成为不可或缺的重要工具，在人类疾病与功能基因的发现、识别，基因与蛋白质的功能研究方面都发挥着关键的作用，如药物设计、基因多态性分析、基因表达调控、疾病相关基因鉴定、基因产物结构与功能预测、基因进化、基于遗传的流行病学、癌症的遗传机制研究等。随着近年来生物实验方法和检测数据的发展，积累了大量生物学，尤其是分子生物学实验数据，通过对这些数据的分类、收集、整理，产生了成千上万的数据库。为了高效处理日益增长的海量生物数据，使全世界的研究人员能共享已有的研究成果，数据库技术在生物数据的处理和储存上有越来越重要的应用。数据库是生物信息学的主要内容，各种数据库几乎覆盖了生命科学的各个领域。目前，生物信息学已广泛地渗透到生命科学的各个研究领域中，成为不可或缺的重要工具，在人类疾病与功能基因的发现、识别，基因与蛋白质的功能研究方面都发挥着关键的作用，如药物设计、基因多态性分ＩＩＩ

中文摘要

析、基因表达调控、疾病相关基因鉴定、基因产物结构与功能预测、基因进化、基于遗传的流行病学、癌症的遗传机制研究等。

生物信息学最使人们感兴趣的是它利用计算方法分析生物数据，如根据核酸序列预测蛋白质序列、结构、功能的算法等。虽然这些预测还不是非常精准，但是当可靠的实验数据还无法得到的情况下，这一预测可以作为一盏路灯，指示你应如何开展实验。利用基因芯片技术和生物信息学方法系统分析肿瘤相关基因及其调控机制，是当前功能基因组学的重要研究手段。它明显优于过去的单一基因研究模式，可以在整体的、基因组的水平对基因的表达调控网络机制进行系统全面的分析。

本研究从ＧＥＯ数据库中下载１５７个前列腺癌转移相关的基因表达谱数据集（ＧＳＭｌ５２９３１～ＧＳＭｌ５２９９１，ＧＳＭｌ５２８５６～ＧＳＭｌ５２８８０，ＧＳＭ７９９４６８—ＧＳＭ７９９４８９

４．３．０和ＣＳＭ７９９４９０～ＧＳＭ７９９５１８）为分析材料，采用ＢＩｍ．ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓＢｅｔａ软件

筛选前列腺癌原发肿瘤和转移肿瘤芯片数据的差异表达基因，再结合生物信息学工具和数据挖掘方法对差异基因及其相互作用关系进行分析，从中发现两个前列腺癌转移高度相关基因ＳＰＰｌ、ＶＣＡＮ，最后再运用生物信息学方法对ＳＰＰｌ、ＶＣＡＮ基因进行结构和功能研究，为前列腺癌癌转移的发病机制提供新的思路，也为转移性前列腺癌的分子诊断和个体化治疗奠定基础。

本研究的内容和过程分为四部分

第一部分：前列腺癌转移相关基因的生物信息学分析

在公共基因芯片数据库（ＧＥＯ）中下载前列腺癌转移的相关基因芯片数据，其中６１例原发性局限性前列腺癌样本，２５例前列腺癌转移样本，利用ＢＩ出．ＡｒｒａｙＴ００１ｓ４．３．０Ｂｅｔａ３软件、ＳＴＲ烈Ｇ、ＴｏｐｐＧｅｎｅ、ＧＯＥＡＳＴ、ＤＡｖＩＤ等

４．３．０Ｂｅｔａ工具对前列腺癌差异基因进行生物信息学分析。通过ＢＲＢ．ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ

３分析筛选出２１０个前列腺癌转移差异基因，其中上调８４个，下调１２６个。对其进行生物信息学分析发现ＡＲ、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＡＣＴＢ、ＦＮｌ、ＭＹＬ９、ＭＹＨｌｌ、ＭＹＬＫ、ＳＰＰｌ等基因以及ＲｈｏＧＴＰａｓｅ调节细胞骨架通路、整合素信号通路、钙粘蛋白信号通路、ｗｎｔ信号通路等信号通路在前列腺癌转移的发生发展中可能起Ⅳ

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着重要作用。

第二部分：前列腺癌骨转移相关基因的生物信息学分析

在公共基因芯片数据库（ＧＥＯ）中下载前列腺癌骨转移的相关基因芯片数据，利用ＢＲＢ．ｍｌｒａｙＴ００ｌｓ４．３．０Ｂｅｔａ３软件、ＳＴ对ＮＧ、ＴｏｐｐＧｅｎｅ、ＧＯＥＡＳＴ、ＤＡⅥＤ

４．３．０等生物信息学工具进行数据挖掘及生物信息学分析。通过ＢＲＢ．ＡｒｒａｙＴ００ｌｓ

Ｂｅｔａ３分析筛选出５０１个前列腺癌骨转移差异基因，其中上调１８１个，下调３２０个。对其进行生物信息学分析发现ＳＰＰｌ、ＨＢＢ、ＡＲ、Ｍ＾佃９、ＡＺＧＰｌ、ＰＯＳＴＮ、ＦＮｌ、ＶＣＡＮ等基因以及胶原蛋白及其生物合成、细胞粘附、小分子代谢过程、黏着斑、ＥＣＭ受体相互作用、细胞周期、整合素信号通路等分子生物学过程及通路在前列腺癌骨转移的发生发展中可能起着重要作用。

第一章前列腺癌转移相关基因的生物信息学分析………………．１８

１材料和方法…………………………………………………………………．１８２结果…………………………………………………………………………．３０３讨论…………………………………………………………………………………………………．．３６

第二章前列腺癌骨转移相关基因的生物信息学分析……………．３９

ｌ材料和方法…………………………………………………………………．３９２结果…………………………………………………………………………………………………．．４７３讨论…………………………………………………………………………………………………．．５２

第三章基于基因芯片的前列腺癌转移基因ＳＰＰｌ的生物信息学分析………………………………………………………………………………………………．５６

１材料和方法…………………………………………………………………．５６２结果…………………………………………………………………………………………………。６４３讨论…………………………………………………………………………………………………．．６９

第四章基于基因芯片的前列腺癌转移基因ＶＣＡＮ的生物信息学分析……………………………………………………………………………………………７２

１材料和方法…………………………………………………………………．７２２结果…………………………………………………………………………………………………．７７３讨论…………………………………………………………………………………………………．．８２结｛沦………………………………………………………………………………………．．８５参考文献…………………………………………………………………８６

目录

英文缩写词表…………………………………………………………．９７攻读博士学位期间的研究成果………………………………………．９８致谢…………………………………………………………………．９９南方医科大学学位论文原创性声明…………………………………１０１统计学证明……………………………………………………………１０２

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—１厶—ＪＬ．

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前列腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ，ＰＣａ）是泌尿系统最常见肿瘤之一，其发病率在美国居男性恶性肿瘤之首，近年来ＰＣａ在中国的发病率也呈稳步升高趋势，ＰＣａ患者一旦发生转移不仅预后差，而且严重影响其生活质量。但到目前为止，前列腺癌转移的分子机制仍未明确以及临床上对前列腺癌转移缺乏有效的治疗手段。随着生物技术的发展，基因芯片的应用使得人们可以从基因水平对疾病的原理进行阐述，而随之出现的生物信息学技术的快速发展，为海量的芯片数据提供了更快捷，更深入的分析方法，从而使肿瘤的转移发生机制在分子水平得到更全面的解释。基于以上设想，本课题拟运用生物信息学方法对前列腺癌转移组织基因芯片数据进行筛选及转移相关基因进行深入分析，并建立分子水平的相关网络图谱，为进一步揭示前列腺癌转移的发病机理、分子诊断、治疗靶点等研究提供理论依据。下面就前列腺癌转移、基因芯片以及生物信息学研究进展，本课题的研究的材料和方法、目的及意义等作一介绍。

一、前列腺癌转移概况

前列腺癌（ｐｒｏｓ饿ｃａｌｌｃｅｒ，ＰＣａ）是危害男性健康最常见的肿瘤之一，其发病率在美国居男性恶性肿瘤之首，占男性死亡原因的第二位，仅此于肺癌【ｌ】。在中国ＰＣａ的发病率远低于西方国家，然而，近２０年来，我国ＰＣａ的发病率也呈现逐年上升趋势，并且发病年龄也日趋年轻化，可能与生活方式、寿命延长、人口老龄化以及诊断技术的提高有关【２１。ＰＣａ多发生在外周带，早期无特异性症状，病变发展到晚期，则多发生局部浸润或远处转移。盆腔淋巴结是ＰＣａ最早和常见转移部位【３１，局限性的ＰＣａ患者５年生存率几乎１００％，而发生远处转移的ＰＣａ患者５年生存率下降到约为２９％，ＰＣａ患者一旦发生转移不仅预后差，而且严重影响其生活质量。骨转移是ＰＣａ重要的临床特征和主要致死原因，美国死于ＰＣａ的患者中，８０％以上合并骨转移。前列腺癌骨转移可导致患者发生骨痛、病理性骨折、脊髓压迫、活动受限等骨相关事件（ｓｋｅｌｅｔａｌｒｅｌａｔｅｄｅｖｅｎｔｓ，ＳＩ冱ｓ）【１，４１。

前言

前列腺癌转移诊断主要依赖临床相关症状、ＰＳＡ、Ｘ片、骨扫描、ＣＴ以及ＭⅪ等，骨扫描是ＰＣａ转移诊断的最重要的诊断方法，骨扫描通过放射性追踪剂显示区分正常和异常骨活动，当怀疑骨转移，ＰＣａ患者出现临床症状或者治疗过程中ＰＳＡ升高应考虑行骨扫描进一步检查。

前列腺癌转移治疗的主要目的是缓解转移灶引起的疼痛，改善患者运动机能，预防或治疗转移灶引发的并发症如脊髓压迫和病理性骨折等。常用的治疗手段有内分泌治疗、双磷酸盐类药物、二线内分泌治疗，化疗、放疗、止痛等。雄激素与正常前列腺细胞与前列腺癌细胞的生长存在密切关系，目前，内分泌治疗仍是目前被证明治疗转移性前列腺癌的最有效治疗手段之一，其目的在于减少或消除雄激素对前列腺生长的促进作用，从而缓解转移性前列腺癌的症状。内分泌治疗通常包括手术去势与药物去势。药物去势通过使用雌激素类药物、抗雄激素类药物或黄体生成激素释放激素类似物等药物以阻断雄激素与雄激素受体的结合或减少体内雄激素的产生【５１。去势治疗（ａｎｄｒｏｇｅｎｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎｔｌｌｅｒ印ｙ，ＡＤＴ）可加速骨质丢失，进一步增加ＳＲＥｓ的发生率。ＳＲＥｓ的发生不仅增加了治疗费用，也严重影响患者的生活质量，甚至降低患者的生存率【６】。转移性前列腺癌患者的内分泌治疗属于姑息治疗。其治疗目的主要是在于减少或消除雄激素对前列腺生长的促进作用，控制前列腺癌的进展，减少相关症状，提高生活质量，目前对于临床医师来讲其治疗仍旧是巨大的挑战【５。７】。

二、前列腺癌转移研究进展

前列腺癌多发生在外周带，早期无特异性症状，病变发展到晚期，则多发生局部浸润或远处转移，ＰＣａ转移的途径主要为血道转移和淋巴道转移，

盆腔淋巴结是ＰＣａ最早和常见的转移部位，骨转移是ＰＣａ最常见的转移的部位，是ＰＣａ重要的临床特征和主要致死原因，ＰＣａ转移的的确切机制目前仍不清楚，包括一系列复杂的过程，呈现多步骤、多阶段、多途径、多基因复合的特点，了解肿瘤转移相关基因的信号传导通路以及对肿瘤转移的作用机制，为寻找抑制肿瘤转移的关键靶点具有重要的意义。其生物学特性复杂、多变，肿瘤２

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新生淋巴管和血管是其转移的重要形态学基础。解剖学可能存在的便利途径以及Ｐａｇｅｔ的“种子和土壤”学说．前列腺癌细胞和微环境成分之间存在特异、强烈的相互作用，最终导致临床转移的发生，现就其转移研究进展现状作一综述。

（一）前列腺癌转移的解剖学基础

淋巴系统由淋巴管、淋巴器官及淋巴液组成，淋巴管从外周组织中收集血浆蛋白、组织液、淋巴细胞等组成的淋巴液，并输送到区域淋巴结，最终汇入静脉，流向心脏，髂外淋巴结有三个淋巴链：内侧链、中链、外侧链。其中，内侧链中有１组淋巴结，位于闭孔神经周围，称为闭孔神经淋巴结，通常被认作ＰＣａ淋巴转移的第一站，ＰＣａ淋巴结转移最早常见于盆腔淋巴结【３】。同时前列腺癌易发生发生骨转移的解剖特点：（１）骨的血液循环丰富。骨的动脉广泛吻合，互相连接，静脉网的直径较大，以适应动脉特点，便于将血液迅速排出。（２）通过脊椎静脉丛（Ｂａｔｓｏｎ脊椎静脉系统）转移至脊椎。Ｂａｔｓｏｎ首次提出，在前列腺与低位腰椎之间可能存在一低压、高血流量的静脉丛，它具有压力低，容积大，与肋间静脉、肺静脉、腔静脉及门静脉广泛交通的特点。导致前列腺癌向脊椎转移的机率增加了，癌细胞容易沿着静脉血流转移至脊柱，并通过各交通静脉转移至骨骼其它部位【引。

（二）前列腺癌转移的“种子和土壤＂学说

前列腺癌细胞容易转移至骨骼，Ｐａｇｅｔ提出的“种子土壤”学说即：在ＰＣａ细胞与骨骼微环境中存在着特异的生物学相互作用。“种子和土壤学说”预示骨微环境中表达许多因子，吸引多种肿瘤细胞的迁移以及促进肿瘤的增殖。而肿瘤细胞自身表达因子又会刺激骨组织的重新塑形。通过肿瘤细胞与其所处生长环境中的双向和动态的作用，促进肿瘤在骨骼中的发展【６～。因此，骨微环境中的多种因子对肿瘤骨转移具有重要意义。

（三）前列腺癌转移分子机制肿瘤转移包括一系列复杂的过程，主要涉及肿瘤细胞由原发部位脱离开始，

前言

到肿瘤细胞在其它转移部位——比如淋巴、骨骼，生长增殖的多个关键性步骤。“种子和土壤学说”预示微环境中表达许多因子，吸引多种肿瘤细胞的迁移以及促进肿瘤的增殖，通过肿瘤细胞与其所处生长环境中的双向和动态的作用，促进肿瘤在骨骼中的发展【６，９１。近来的研究表明血管内皮生长因子ｍｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｌｌｅｌｉａｌ研ｏｗｔｌｌＦａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）家族家族及其受体在ＰＣａ淋巴管生成、淋巴转移以及骨转移中具有重要作用，这为了解前列腺癌淋巴结及骨转移转移的分子机制提供了可能。ＶＥＧＦ家族是一类多功能的细胞因子，包括ＶＥＧＦ＿Ａ、ＶＥＧＦ—Ｂ、ＶＥＧＦ—Ｃ、ＶＥＧＦ—Ｄ等，而已有研究表明，ＶＥＧＦ与其受体（ＶＥＧＦＲ）在肿瘤血管生成及淋巴管生成中发挥着重要的促进作用，可增加内皮细胞的渗透性，促进内皮细胞进行分裂、增殖，并有利于细胞进行迁移，在体内所表现出了特异性促血管生成作用，参与肿瘤血管生成和淋巴管形成【１０。１２】。ＶＥＧＦ．Ｃ通过其受体ＶＥＧＦＲ－３信号通路在调节淋巴系统的生成与肿瘤的淋巴转移中功能中发挥着重要作用，血管内皮生长因子受体．３ⅣＥＧＦＲ－３）属于ＶＥＧＦ酪氨酸激酶受体家族成员，激活ＶＥＧＦＲ．３信号能促进淋巴内皮细胞增殖和迁移【１２，ｌ３１。Ｂｕｎｏｎ等【１４】发现抑制ＶＥＧＦ．ＣⅣＥＧＦＲ－３信号转导，能够减少前列腺肿瘤细胞的淋巴转移。ＤｉＪＭ等【１５】证实ＣＯＸ．２通过调节ＶＥＧＦ．Ｃ的表达在前列腺癌淋巴血管生成及淋巴转移中起重要作用。最近有研刭１６】认为，通过增加ＶＥＧＦ．ｃ的表达水平可以激活ＶＥＧＦＲ．３，二者特异性结合后，能够刺激血管生成，促进前列腺肿瘤细胞生长，启动肿瘤细胞淋巴转移以及增加远处转移的概率。同时在前列腺肿瘤中通过ＶＥＧＦ．Ａ激活ＶＥＧＦＲ－１以及通过ＶＥＧＦ．Ｄ激活淋巴内皮细胞ＶＥＧＦＲ－３可能是其进展转移的重要机制旧。已有研究表明ＶＥＧＦ的过表达是前列腺癌转移的早期步骤，其过表达与前列腺癌预后密切相关，通过阻断ＶＥＧＦ信号途径，可从血管、淋巴管两方面抑制肿瘤的生长和转移，ＶＥＧＦ已成为一种重要的前列腺癌转移的治疗选择靶点之一【１８】。同时ＶＥＧＦ是成骨细胞活动的介质，骨形态发生蛋白（ｂｏｎｅｍｏ印ｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＢＭＰｓ）可诱导ＶＥＧＦ蛋白和ｍＲＮＡ在癌细胞中表达，因此ＶＥＧ－Ｆ也可能是前列腺癌成骨性骨转移的分子机制之一【１９】。在肿瘤的侵袭和转移过程中，细胞外基质（ｅｘ缸ａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）和基底膜是４

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重要组织屏障，其与肿瘤的生物学行为及预后的关系是当前人们研究肿瘤生物行为的热点之一【２０，２１１，基质金属蛋白酶（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｒ粥ｅｓ，Ｍ＾佃ｓ）是一种由肿瘤细胞或间质细胞分泌的、可以降解ＥＣＭ的蛋白酶家族，基质金属蛋白酶９（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉＩ娜ｅ９，ＭＭＰ．９）是Ｍ＾佃ｓ家族的重要成员之一【２２】，趋化因子（ＣＸＣＬｌ２）及其受体ＣＸＣＲ．４在肿瘤的发生发展中日益重要【２３】。在ＣＸＣＬｌ２与ＣＸＣＲ４结合的过程中可以激活ＡＫｔｌ和肿瘤细胞分泌ＭＭＰ．９，而ＭＭＰ．９正是肿瘤细胞侵袭、骨转移的关键分子之一【２４】。进一步的研究表明通过激活舭１调节ＣＸＣＬｌ２／ＣＸＣＲ４信号通路促进肿瘤细胞的生长及骨转移【２５１。此外，Ｗ缸ｇＱ等通过ＲＮＡ干扰技术发现ＣＸＣＲ４上调前列腺癌细胞的ＶＥＧＦ和ＭＭＰ．９的表达在进前列腺癌骨转移中起重要作用【２６。。前列腺癌骨转移绝大多数为成骨性表现，但研究表明，前列腺癌发生骨转移时，成骨性和溶骨性改变是同时存在的，骨质中前列腺癌细胞的存在刺激骨基质的降解和新骨形成。已有的研究发现前列腺癌细胞能够分泌多种刺激骨形成的细胞因子，如甲状旁腺激素相蛋白（ｐａｒａｔｌ肌ｏｉｄｈｏｍｏｎｅ．ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｌｌ，Ｐｎｍ，，）、骨形态发生蛋白（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＢＭＰｓ）、ＲＡＮＫＬ、内皮素１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉＩｌ－１，ＥＴ－１）、证＇Ａ、Ｗｎｔ等【２１７１。ＰＴ｝ｈ．Ｐ在骨转移过程中发挥了重要作用，研究发现ＰＴ｝ｈ．Ｐ在前列腺癌骨转移灶丰富表达，ＰＴ｝ｈＰ促进成骨性改变。前列腺癌自分泌ＰＴ｝ｈＰ刺激成骨细胞增殖和诱导成骨细胞分化【２８１。研究证实，前列腺癌细胞自身分泌的ＰＴＨｒＰ通过内分泌途径诱导ＥＭＴ（ｅｐｉ也ｅｌｉａｌ．ｔｏ．ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ缸．趾ｓｉｔｉｏｎ）来增强前列腺癌细胞侵袭和转移能力，参与前列腺癌的骨转移【２９】。因此ＰＴＨｒＰ的自分泌特性在前列腺异常增殖及前列腺癌骨转移过程中起着重要作用。骨形态发生蛋白（ｂｏｎｅｍｏｒｌ出ｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）属于ＴＧＦ．Ｂ超家族成员，在前列腺癌骨转移中诱导成骨改变中起重要作用【３０】，最近的研究发现骨髓干细胞分泌ＢＭＰ７通过刺激ｐ３８－ＮＤＩⅪ１通路诱导前列腺癌干细胞休眠和复发，ＢＭＰ７与前列腺癌骨转移的发生发展密不可分，ＢⅧ７也已成为前列腺癌骨转移治疗的一个潜在靶点【３１１。ＲＡＮＫＩ，是由破骨细胞产生，属于细胞因子ＴＮＦ超家族成员之一，在成骨细胞和破骨细胞的关系中，研究最为清楚的是ＲＡＮＫＩ，与其受体细胞核因子ＫＢ受体

前言

活化因子（ｒｅｃｅｐｔｏｒａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆＮＦ．ＫＢ，ＲＡＮＫ），凡蝌ＫＬ可以与凡蝌Ｋ结合导致破骨细胞激活造成溶骨现，进一步的研究发现通过激活前列腺癌细胞ＮＦ．心信号上调破骨基因的表达增加破骨发生，促进骨转移形成【２７，３２１。因此，微环境中产生的因子对肿瘤转移具有重要意义。

（四）展望

前列腺癌转移是一系列复杂而有序的过程，其临床表现及转归也不尽相同，对转移机制的研究尚待继续深入。与此同时，遗传学及分子生物学研究正努力寻找敏感、有效的判断肿瘤发生、发展及转移的标记物，用于临床指导治疗方案的选择，为ＰＣａ转移的治疗奠定坚实的基础。在肿瘤细胞的转移过程中，涉及了细胞生长和代谢能力增强；细胞间同质粘附能力的降低；细胞与ＥＣＭ间异质粘附能力的增强；细胞迁移和运动能力的增强；细胞自身产生及诱导宿主细胞产生降解ＥＣＭ和基底膜的蛋白酶增加及分泌蛋白酶抑制剂的减少；促肿瘤血管生成能力增强；肿瘤细胞产生器官特异的趋向性；肿瘤细胞逃避宿主的免疫监视等等。同时肿瘤细胞转移过程中的粘附、运动、蛋白水解、血管生成、组织趋向和免疫逃逸等都涉及肿瘤组织内肿瘤细胞自身和肿瘤细胞与肿瘤微环境的相互作用的信号传导的调节。因此，肿瘤细胞转移能力的获得是肿瘤组织细胞的一系列基因改变调控的，包括转移促进基因和转移抑制基因，其中包括部分与肿瘤发生相关的癌基因和抑癌基因，它们在不同患病个体的肿瘤细胞内表达的区别决定了不同患者间转移潜能的。肿瘤转移相关基因的筛选研究是目前肿瘤转移研究领域的热点，它可以为转移机制的研究提供线索，为转移的诊断提供分子标志，为患者的预后评估提供客观指征，为抗转移治疗提供靶点。

三、基因芯片及应用

（一）基因芯片技术

基因芯片是２０世纪９０年代中期以来随着人类基因组计划快速发展起来的分子生物学高新技术，具有高通量、高集成、微型化、平行化、多样化和自动化６

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等特点它能够平行、高通量地检测成千上万基因转录体的表达水平，基因芯片已广泛应用于疾病基因表达谱分析、寻找疾病相关基因、药物作用靶标、肿瘤预后、复杂疾病的致病机制分析等方面，为个体化诊断和治疗提供指导，也可以揭示基因间的表达调控关系，同时它在制药和临床研究中也有重要的作用１３引。随着基因芯片数据的高速增长，需要对这些数据进行收集、存储和管理，目前基因表达数据相关的公共数据库包括ＧＥＯ、ＳＭＤ、加碹ｙＥｐｒｅｓｓ等。ＧＥＯ（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｒｍ曲ｕｓ）数据斟３４】是由美国国立生物信息技术中心（Ｎａｔｉｏ蹦ｃｅｎｔｅｒ

Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）管理和维护的公共数据库，是经过专家整ｆｏｒＢｉｏｔｅｃｌｌＩｌ０１０９ｙ

理和核对的在线基因芯片数据库资料，主要储存基因芯片数据，提供基因芯片数据的浏览、查询、检索和下载。是目前世界上最大的基因表达谱公共数据库，至２０１４年２月共收集了来自于全世界生物学研究个实验室提交的大约４万份研究包含了超过１００万个样本。斯坦福芯片数据库（ＳⅧ）【３５】是由美国斯坦福大学管理和维护的基因表达的公共数据库，Ｓ加储存芯片实验得到的原始和标准化数据，提供网页界面进行数据检索、分析和可视化。ＲｙｂａｃｚｙｋＬ等通过ＣＡＧＥＳ方法分析和整合不同的肠道炎症疾病研究，对ＧＥＯ数据库的所有来自于人的Ｃｒｏｌｌｎ’ｓ病和溃疡性结肠炎的基因芯片数据库进行挖掘发现２２个疾病敏感相关的嘌呤基因［３６１。ＷａｎｇＬ等通过对ＧＥ０挖掘来自于不同实验室的的不同人体组织的２９６８个基因芯片表达谱进行生物信息学分析，筛选出２０个潜在的脑、肝以及组织选择性基因【３７１。Ｉ沁“ｇｕｅｓＩ汛等通过对肝癌基因表达谱数据集生物信息学分析发现ＷＮＴ、ＰＣＮＡ、ＴＧＦ、ＴＰ５３等特异表达基因以及细胞增殖、细胞周期控制、凋亡在肝癌发生、发展中起重要作用【３引。在进入后基因组时代的背景下，基因芯片技术将得到更为广泛的应用，芯片数据的功能分析也必然将发挥更重要的作用。

（二）基因芯片数据分析及软件

基因芯片提供了包括基因功能、基因相互作用等海量信息，这些数据为功能能基因组研究提供了重要的资源，ＧＥＯ、ＳＭＤ、岫Ｅｘｐｒｅｓｓ等数据库在基因

前言

芯片的归类、储存、资源共享等方面提供有利帮助。数据是知识和信息的重要来源，对于这些数据己经无法通过简单的计算和分析来进行，因此，如何采用一些新的方法和技术来有效分析这些庞大的基因芯片，并从中挖掘和揭示蕴藏的、有意义的生物学信息，是当前基因芯片领域亟待解决的重要课题。

基因芯片的分析主要包括前期的实验设计、数据预处理和后期的详细分析等步骤【３３，３射。实验设计是芯片数据可靠的前提，是芯片实验研究中重要的一部分。由于获取的芯片原始数据来自不同的芯片平台，数据信息会有差异，往往需要前期的数据预处理以后才能进行深层次的数据挖掘，数据预处理主要通过数据提取、数据对数转化、数据过滤、补缺失值和标准化处理等方法减少原始数据中的误差，进一步增强数据可靠性。后期详细分析主要集中于差异表达基因筛选和聚类分析两个方面。筛选差异表达基因是为了发现在不同实验条件下或不同实验样品中表达发生显著性改变的基因。筛选出的差异表达基因，对于发现疾病的分子诊断标志物、药物作用靶点等方面具有重要的意义。聚类分析是基于研究对象属性的相似性对研究对象进行分组，使组内样本相似，组间有差异。可以将多个基因进行归类，位于同一个类的基因在功能上可能相似或相关。此外，基因芯片后期数据挖掘的一个重要方向是进行基因芯片数据的生物学意义分析。

目前，已经有许多方法用来分析基因芯片数据，如ＢＩｍ．ＡｍｗＴ００１ｓ４．３．０Ｂｅｔａ、Ｄｃｈｊｐ、Ｓ削Ⅵ、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ、Ｃｌｕｓｔｅｒ、ＴｒｅｅⅥｅｗ等基因芯片表达谱数据分析软件，ＢＲＢ．ＡｒｒａｙＴ００ｌｓ

博士学位论文

具对前列腺癌差异基因进行数据挖掘和生物信息学分析。通过ＢＲＢ．Ａ删ｙＴｏｏｌｓ

４．３．Ｏ

Ｂｅｔａ分析筛选出２１０个前列腺癌骨转移差异基因，其中上调８４个，下调１２６

个。对其进行生物信息学分析发现ＡＲ、ＦＯＳ、几肘、ＡＣＴＢ、ＦＮｌ、ＭＹＬ９、ＭＹＨｌｌ、ＭＹＬＫ、ＳＰＰｌ等基因以及ＲｈｏＧＴＰ嬲ｅ调节细胞骨架通路、整合素信号通路、钙

粘蛋白信号通路、Ｗｎｔ信号通路等信号通路在前列腺癌转移的发生发展中可能起

着重要作用。

（二）前列腺癌骨转移相关基因的生物信息学分析

通过在公共基因芯片数据库（ＧＥＯ）中下载前列腺癌骨转移的相关基因芯片数据，利用ＢＩ也－Ａ玎ａｙＴ００ｌｓ４．３．ＯＢｅｔａ软件、ＳＴＲＮＧ、ＴｏｐｐＧｅｎｅ、ＧＯＥＡＳＴ、ＤＡＶＩＤ等生物信息学工具进行数据挖掘和生物信息学分析。通过

ＢＲＢ．ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ４．３．０

Ｂｅｔａ分析筛选出５０１个前列腺癌骨转移差异基因，其中上

调１８１个，下调３２０个，对其进行生物信息学分析发现ＳＰＰｌ、Ⅷ强、ＡＲ、Ｍ＾佃９、ＡＺＧＰｌ、ＰＯＳＴＮ、ＦＮｌ、ＶＣＡＮ等基因以及胶原蛋白及其生物合成、细胞粘附、小分子代谢过程、黏着斑、ＥＣＭ受体相互作用、细胞周期、整合素信号通路等

分子生物学过程及通路在前列腺癌骨转移的发生发展中可能起着重要作用。（三）前列腺癌转移相关基因ＳＰＰｌ的生物信息学分析

通过公共基因芯片数据库（ＧＥ０）中下载前列腺癌转移的相关基因芯片数

据，利用ＢＩ淝－ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ

４．３．Ｏ

Ｂｅｔａ软件、ｐｒｏｔｐ祗蛆、ＭｏｔｉｆｓｃａＩｌ、ＳｉｇｎａｌＰ

４．０、

ＴＭｍ心嗄、ＮｅｔＰｈｏｓ２．０、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｌｌ、ＧＯ、ＫＥＧＧ、ＳＴⅪＮＧ等生物信息学工

具进行数据挖掘及生物信息学分析。共筛选出前列腺癌转移共同差异基因７３个，其中表达上调２１个，表达下调２１个，同时对前列腺癌转移高表达基因ＳＰＰｌ进行生物信息学发现，ＳＰＰｌ蛋白由３１４个氨基酸组成，其相对分子质量为３５４２２．７，该蛋白含有２个Ｎ．连接糖基化位点、８个酪蛋白激酶ＩＩ磷酸化位点、

２个豆蔻酰基化位点、３个ＰＫＣ磷酸化位点，主要参与细胞因子活动、细胞外基质结合、骨化、成骨细胞分化、炎症反应、细胞粘附等分子功能及生物学过程以及参与Ｐ１３Ｋ－Ａｈｓｉ弘ａｌｉｎｇ

ｐａ廿１、Ⅳａｙ、Ｆｏｃａｌ

ａｄｈｅｓｉｏｎ、ＥＣＭ－ｒｅｃ印ｔｏｒ

ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、

前言

Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｇｌｌａＪｉｌｌｇ

ｐ甜１ｗａｙ等信号通路。

（四）前列腺癌转移相关基因ＶＣＡＮ的生物信息学分析

通过公共基因芯片数据库（ＧＥＯ）中下载前列腺癌转移的相关基因芯片数

据，利用ＢＩｍ－ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ

４．３．０

Ｂｅｔａ软件、ｐｒｏｔｐ娥Ⅱｎ、ＳＭＡＲＴ、Ｓｉ弘ａｌＰ

４．０、

ＴＭＨＭＭ、ＮｅｔＰｈｏｓ２．Ｏ、ＰｒｅｄｉＣｔＰｒｏｔｅｉｌｌ、ＳＷＩＳＳ．ＭＯＤＥＬ、ＧＯ、ＫＥＧＧ、ＳＴＲＩＮＧ

等生物信息学工具进行数据挖掘及生物信息学分析。共筛选出前列腺癌转移共同差异基因７３个，其中表达上调２１个，表达下调２１个，其中对前列腺癌转移高表达基因ＶＣＡＮ进行生物信息学发现，ＶＣＡＮ蛋白由３３９６个氨基酸组成，其相对分子质量为３７２８２０．０，该蛋白含有１个ＩＧ（ｈｎｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）结构域、２

个Ｌｉｎｋ（ＨＡ，ＨｙａｌｕｒｏｎａＩｌ－ｂｉｎｄｉｎｇ）结构域，１个ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｍａｌ

ｄｏｍａｉｎ）结构域、１个ＥＧＦＣＡ（Ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ

ＥＧＦ．１ｉｋｅ

ｇｒｏｗｍｆＩａｃｔｏｒ－ｌｉｋｅ

ｄｏｍａｉｎ）结构域、１

个ＣＬＥＣＴ（Ｃ—ｔｙｐｅ１ｅｃｔｉｎ）结构域和１个ＣＣＰ（Ｄｏｍａｉｌｌ

ｃｏｎ缸Ｄｌ

ａｂｕＩｌｄａｎｔｉｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ

ａｃｉｄ

ｐｒｏｔｅｉｌｌｓ）结构域，主要参与细胞粘附、透明质酸结合（ｈｙａｌｕｒｏｎｊｃ

ｂｉｎｄｉｎｇ）、钙离子结合、糖胺聚糖结合（９１ｙｃｏｓａｎｌｍｇｌｙｃａＩｌ

质、ＣｅＵａｄｌｌｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（ＣＪ～Ｍｓ）等分子功能及信号通路。七、研究目的与意义

ｂｉｎｄｉＩｌｇ）、细胞外基

（一）从分子水平揭示了前列腺癌转移的发生机制

随着生活方式的改变及人口的老龄化等因素的影响，我国前列腺癌发生率的逐年增长已成为一个不可避免的问题，对男性健康造成严重威胁。前列腺癌

多发生在外周带，早期无特异性症状，病变发展到晚期，则多发生局部浸润或远处转移，盆腔淋巴结是ＰＣａ最早和常见转移部位，骨转移是ＰＣａ重要的临床特征和主要致死原因，局限性的ＰＣａ患者５年生存率几乎１００％，而发生远处转移的ＰＣａ患者５年生存率下降到约为２９％，前列腺癌患者一旦发生转移不仅预

后差，而且严重影响其生活质量。转移性前列腺癌患者的内分泌治疗属于姑息

治疗，其治疗目的主要是在于减少或消除雄激素对前列腺生长的促进作用，控

博士学位论文

制前列腺癌的进展，减少相关症状，提高生活质量，目前对于临床医师来讲其治疗仍旧是巨大的挑战。前列腺癌转移发生的的机制很多，但是确切的致病机理不是很清楚。因此确定前列腺癌转移相关基因集，通过生物信息学的方法对ＰＣａ相关基因集进行分析，从基因表达水平探讨了ＰＣａ转移发生的可能分子机制。同时构建了ＰＣａ转移发生相关基因相互作用网络，为前列腺癌发生分子机

制研究提供了新的研究思路。

（二）为临床诊治提供基因靶点及新治疗药物

研究前列腺癌转移相关基因集，能为ＰＣａ的临床早期诊断、预防、易感性预测及治疗提供分子靶点及药物作用靶点；这对提高前列腺癌转移的疗效及预后的判断有指导作用。

（三）为肿瘤的发病机制及治疗靶点筛选提供新的思路

利用ＢＲＢ．Ａ盯ａｙＴｏｏｌｓ

４．３．Ｏ

Ｂｅｔａ软件对前列腺癌相关基因进行筛选以及生物

信息学对数据进行再次挖掘，可以找到有意义的生物信息，为肿瘤的发病机制及治疗靶点的筛选提供新的思路同时又避免资源浪费。

第一章前列腺癌转移相关基因的生物信息学分析

第一章前列腺癌转移相关基因的生物信息学分析

前列腺癌（ｐｒｏｓ讹ｃａｌｌｃｅｒ，ＰＣ）是泌尿系统最常见肿瘤之一，其发病率在美

国居男性恶性肿瘤之首，占男性死亡原因的第二位，仅此于肺癌【ｌ】。近２０年来，，与生活方式、寿命延长、人口老龄化以及诊断技术的提高有关【２】。前列腺癌多发

生在外周带，早期无特异性症状，病变发展到晚期，则多发生局部浸润或远处转移。盆腔淋巴结是ＰＣａ最早和常见转移部位【３１，骨转移是ＰＣａ重要的临床特

征和主要致死原因，局限性的ＰＣａ患者５年生存率几乎１００％，而发生远处转移的

而且严重影响其生活质量【１，４１。

基因芯片是２０世纪９０年代中期以来随着人类基因组计划快速发展起来的

分子生物学高新技术，具有高通量、高集成、微型化、平行化、多样化和自动化等特点它能够平行、高通量地检测成千上万基因转录体的表达水平，基因芯片已广泛应用于疾病基因表达谱分析、寻找疾病相关基因、恶性肿瘤相关基因的

筛查、药物作用靶标、肿瘤预后、复杂疾病的致病机制分析等方面口３，３８｜。本研究

利用基因芯片分析软件ＢＲＢ—ＡｒｒａｙＴｏＯｌｓ

４．３．０

Ｂｅｔａ对来自基因芯片公共数据

库ＧＥＯ的前列腺癌转移基因表达谱芯片数据作进一步生物信息学分析，从而进一步了解前列腺癌转移发病的分子机理，为肿瘤防治找到一些有效手段。

１材料和方法

１．１芯片平台

本研究所用到的芯片数据平台是ＧＰＬ８３００芯片平台【３４１（［ＨＧＵ９５Ａｖ２］

Ａ蛳ｎｅｔｒｉｘ

ＨｕｍａＩｌＧｅｎｏｍｅＵ９５Ｖｅｒｓｉｏｎ２Ａｒｒａｙ），是Ａ毋，Ｉｎｅｔｒｉｘ的产品，代表

１０，０００条人全长基因，其基本信息见（表１．１），截至２０１４年３月，ＧＰＬ８３００平台总共包含了２８７个ＧＳＥ中的５３０９个样品芯片数据信息。本研究涉及的ＧＳＥ６９１９

我国前列腺癌的发病率也呈现逐年上升趋势，并且发病年龄也日趋年轻化，可能

ＰＣａ患者５年生存率下降到约为２９％，前列腺癌患者一旦发生转移不仅预后差，

———————————————羔堂堡笙查

数据集的８６个样本均采用ＧＰＬ８３００芯片平台。

表１—１Ｔ曲．１－１

３ｔａ【ｍｓ１‘１。

ＧＰＬ８３００基因芯片平台基本信息

Ｂ舔ｉｃｉ１１ｆ研ｍａｔｉｏｎ０ｆＧＰＬ８３００

—瓦ｉ————一—葡赢而丽孬丽——————————一——磊ｉ——————～——＝＝ｉ＝＿＝＿＿————————————一ｖ蕊ｉ彻五二厂—～

ＰｌＩｂｌｉｃｏｎＭａｒｌ６．２００９

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  本文关键词：前列腺癌转移相关基因的生物信息学分析及功能预测，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：154145