【摘要】：背景:以可口可乐为代表的含糖碳酸饮料(sugar-sweetened soft beverage,SSSB)已成为人们膳食结构的一部分。全世界每秒钟约有10450人享用可口可乐公司所生产的饮品。2003-2014年中国居民饮料人均消费量上升速度十分显著,2014年人均消费量是2003年的10倍,儿童饮用含糖饮料的行为越来越普遍。流行病学调查发现,长期摄取SSSB的儿童青少年有明显的异常情绪行为,如感到悲伤和绝望、注意力不集中、打架斗殴甚至有自杀的想法和行动。儿童青少年精神疾患与SSSB的摄入量呈“J”型剂量反应关系。动物实验表明,过量摄取SSSB导致的小鼠学习记忆能力降低与海马腺苷受体(adenosine receptors,ARs)异常有关。ARs属G蛋白偶联受体(G protein coupling receptors,GPCRs)家族成员,是治疗神经精神疾病的重要靶点。临床研究和动物实验都发现,腺苷受体2a(adenosine receptor 2a,A2aR)通过中枢单胺类神经递质、神经炎症、神经营养因子、应激反应等多方面对大脑功能产生影响;使用A2aR拮抗剂能有效缓解抑郁、焦虑、阿尔茨海默症等神经精神疾病。过度激活的A2aR与多巴胺受体2(dopamine receptor 2,D2R)竞争性结合GPCRs,引起下游信号转导异常。运动具有良好的抗抑郁效应,规律的运动能够缓解小鼠的抑郁情绪。然而,SSSB是否会导致小鼠出现抑郁行为,是否与A2aR信号转导障碍有关及运动的抗抑郁机制尚不清楚。目的:本研究将探讨SSSB对小鼠抑郁行为的影响,以及A2aR介导的信号通路在运动抗抑郁中的作用。旨在从现代社会膳食结构的改变初步揭示儿童青少年异常情绪行为的成因以及运动的矫正作用和机制。方法:本实验选用上海斯莱克实验动物中心购买的4周龄雄性C57BL/6小鼠32只,体重14~16g。随机分为4组,每组8只,包括(1)饮水安静组(WS):纯净水、普通饲料,安静饲养;(2)可乐安静组(KS):可口可乐、普通饲料,安静饲养;(3)饮水运动组(WE):纯净水、普通饲料,跑台运动;(4)可乐运动组(KE):可口可乐、普通饲料,跑台运动。适应性饲养1周后,WE、KE组小鼠进行适应性运动,为期1周,第3-14周正式训练。每周固定时间对小鼠称重,并记录小鼠体重。运动干预12周后,进行行为学检测,包括悬尾实验(TST)、强迫游泳实验(FST)和开场实验(OFT)。行为学实验结束后,麻醉小鼠,进行心脏取血、剥离下丘脑、海马组织,采用Elisa检测血清生长激素(GH)、生长激素释放肽(GHRP)的浓度;采用RT-PCR检测下丘脑腺苷受体2a(A2aR)、蛋白激酶A(PKA)、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)、CREB转录调节共激活剂1(CRTC1)、脑源性神经营养因子(BDNF)、5-羟色胺受体1A(5-HT1A)、单胺氧化酶-A(MAO-A)、儿茶酚氧位甲基转移酶(COMT)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)及c-jun氨基末端激酶(JNK)的mRNA表达水平;采用Western blotting检测海马A2aR、PKA、CREB、CRTC1、BDNF的蛋白表达水平。结果(1)对小鼠生长情况的研究发现:与WS组相比,KS组小鼠体重、Lee指数及血清GH水平均显著降低(p0.05),血清GHRP无显著性差异(p0.05);WE组小鼠体重、Lee指数有非常显著性降低(p0.01),血清GH和GHRP水平均无显著性差异(p0.05)。与KS组相比,KE组小鼠体重在第3周显著降低(p0.05),第13周有非常显著性升高(p0.01),Lee指数有非常显著性降低(p0.01),血清GH水平有升高趋势(p=0.07),GHRP水平无显著性差异(p0.05)。表明SSSB能够抑制小鼠生长,而运动能够促进小鼠生长。(2)行为学检测发现:与WS组相比,KS组小鼠在TST的挣扎时间有非常显著性降低(p0.01),FST的挣扎时间(p=0.08)和OFT的中央活动时间(p=0.06)有降低趋势,FST的漂浮时间有升高趋势(p=0.08),TST的晃动时间和OFT的边缘时间无显著性差异(p0.05);WE组小鼠在OFT的边缘时间有非常显著性降低(p0.01),FST的挣扎时间(p=0.05)和OFT的中央活动时间(p=0.06)有升高趋势,FST的漂浮时间、TST的晃动时间和挣扎时间均无显著性差异(p0.05)。与KS组相比,KE组小鼠在FST的挣扎时间和TST的晃动时间有非常显著性升高(p0.01),TST的挣扎时间显著性降低(p0.05),OFT的中央活动时间有升高趋势(p=0.07),FST的漂浮时间有降低趋势(p=0.06),OFT的边缘时间无显著性差异(p0.05)。表明SSSB能够诱导小鼠出现抑郁行为,而运动改善了小鼠的抑郁行为。(3)对A2aR-PKA-BDNF信号通路基因及蛋白水平的研究发现:与WS组相比,KS组小鼠下丘脑A2aR、CREB和CRTC1 mRNA水平均有非常显著性升高(p0.01),BDNF mRNA水平显著升高(p0.05),PKA mRNA水平无显著性差异(p0.05);WE组小鼠下丘脑A2aR、CREB、CRTC1和BDNF mRNA水平均有非常显著性升高(p0.01),PKA mRNA水平显著升高(p0.05)。与KS组相比,KE组小鼠下丘脑CREB mRNA水平显著升高(p0.05),BDNF mRNA水平有升高趋势(p=0.09),A2aR、PKA和CRTC1 mRNA水平均无显著性差异(p0.05)。与WS组相比,KS组小鼠海马A2aR和PKA蛋白水平显著升高(p0.05),CRTC1蛋白水平显著降低(p0.05),CREB和BDNF蛋白水平无显著性变化(p0.05);WE组小鼠海马PKA和CREB蛋白水平显著升高(p0.05),A2aR、CRTC1和BDNF蛋白水平无显著性差异(p0.05)。与KS组相比,KE组小鼠海马A2aR和PKA蛋白水平有非常显著性降低(p0.01),BDNF蛋白水平有非常显著性升高(p0.01),CRTC1水平显著升高(p0.05),CREB蛋白水平有升高趋势(p=0.08)。表明SSSB可能通过激活A2aR引起下游信号通路转导从而诱导抑郁;而运动能够降低海马A2aR蛋白水平、增加CRTC1和BDNF蛋白的表达,从而改善抑郁行为。(4)对单胺类神经递质相关基因的研究发现:与WS组相比,KS组小鼠下丘脑COMT mRNA水平有非常显著性升高(p0.01),5-HT1A和MAO-A mRNA水平无显著差异(p0.05);WE组小鼠下丘脑COMT mRNA水平有非常显著性升高(p0.01),MAO-A mRNA水平显著升高(p0.05),5-HT1A mRNA有升高趋势(p=0.07)。与KS组相比,KE组小鼠下丘脑5-HT1A mRNA有升高趋势(p=0.06),MAO-A和COMT mRNA水平无显著性差异(p0.05)。下丘脑A2aR基因水平与5-HT1A和COMT mRNA水平呈显著正相关(p0.01),与MAO-A mRNA水平无显著相关关系(p0.05)。表明SSSB对小鼠抑郁行为的影响可能与单胺类神经递质相关基因代谢障碍有关。(5)对中枢炎症因子的研究发现:与WS组相比,KS组小鼠下丘脑IL-1βmRNA水平有升高趋势(p=0.08),IL-6、IL-10和JNK mRNA水平均无显著性差异(p0.05);WE组小鼠下丘脑IL-1β和IL-10 mRNA水平有非常显著性升高(p0.01),JNK mRNA水平显著降低(p0.05),IL-6 mRNA水平有升高趋势(p=0.06)。与KS组相比,KE组小鼠IL-1β、IL-6、IL-10 mRNA水平显著升高(p0.05),JNK mRNA水平有非常显著性升高(p0.01)。下丘脑A2aR mRNA水平与IL-1β、IL-6、IL-10 mRNA水平呈显著正相关(p0.01),与JNK mRNA水平呈正相关(p0.05)。表明SSSB对小鼠抑郁行为的影响可能与中枢炎症因子水平改变有关。结论(1)长期摄取SSSB导致小鼠出现抑郁行为,运动能改善小鼠的抑郁行为。(2)长期摄取SSSB导致的抑郁行为可能与A2aR-PKA-BDNF信号通路改变有关,运动导致海马A2aR蛋白水平降低并激活PKA-BDNF信号通路,从而改善抑郁行为。(3)下丘脑A2aR表达水平与5-HT1A、COMT及炎症因子水平呈正相关,表明SSSB与运动对抑郁行为的影响,与单胺类神经递质相关基因及中枢炎症水平有关。意义:本研究探讨了长期摄取SSSB作为一种不健康的饮食方式对小鼠抑郁行为的影响及A2aR-PKA-BDNF信号通路在运动抗抑郁中的介导机制;在此基础上,进一步探究了A2aR基因表达水平与单胺类神经递质相关基因及中枢炎症因子的相关关系,发现SSSB导致的A2aR信号传导障碍可能与单胺类神经递质相关基因及中枢炎症因子表达异常有关。该结果将为运动抗抑郁的研究及临床抗抑郁治疗提供理论依据。
【图文】：
图 1-1 腺苷受体与 G 蛋白偶联受体的偶联[17]Figure 1-1．Adenosine receptor subtypes are coupled to G-protein coupled receptors2 A1R、A2aR 对抑郁、焦虑和攻击行为的影响抑郁症又称抑郁障碍（major depressive disorder，MDD），以显著且持久的心境低落、认知记忆能力降低、反应迟缓、注意力不集中，对事物丧失兴趣等为主要临床表现，患者甚至出现悲观厌世、企图自杀的行为。大量研究表明，抑郁常伴随焦虑和攻击行为而发生，，焦虑是抑郁患者的情绪反应，攻击是抑郁患者的行为表现[18, 19]。提高大脑 ADE 或 A1R 的浓度是临床常用的抗抑郁手段。动物研究表明，A1R 敲除小鼠表现出明显的抑郁症状，且对睡眠剥夺诱导的抗抑郁效应产生抵抗[10]。ADE 介导的 A1R 信号能够缓解缺血性脑损伤导致的纹状体 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric，GABA）能突触传递抑制[20]。外源性补充酮产生的抗焦虑
8 小结与展望基于以上综述分析，运动对抑郁症的改善作用可能与运动抑制了 A2aR 的表达有关，其具体机制可能与神经内分泌功能紊乱、神经营养因子表达障碍、中枢神经递质分泌异常、中枢炎症反应增加等一系列症状改善密不可分。（图 1-4）。GPCRs 是一大类重要的膜蛋白受体，其在情绪行为、免疫系统、自主神经系统等方面发挥着重要的信号调节作用，因此，对 A2aR 在抗抑郁病理机制中的研究显得尤为重要。运动可能通过抑制 CNSA2aR 的表达，引起下游不同信号分子的激活或抑制发挥抗抑郁效应。目前，虽有很多抗抑郁药物相继问世，但这些药物在改善抑郁症状的同时会产生一定副作用，给患者带来诸多困扰。因此，对 A2aR的研究可能会成为运动抗抑郁机制的新靶点，从而为临床抗抑郁治疗提供指导。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：G804;R749.4
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