氧化应激损伤骨骼肌成肌分化中线粒体生物节律的机制研究

发布时间：2020-06-10 04:12

【摘要】：研究目的:本研究以C2C12成肌细胞为研究对象,利用外源性叔丁基过氧化氢孵育制备氧化应激细胞模型,观察成肌分化进程中线粒体稳态及生物钟相关蛋白表达的动态规律,以探讨氧化应激对成肌分化进程中线粒体生物节律的调控机制。并对线粒体稳态进行干预,拟验证线粒体是否可逆向调控生物钟。研究方法:(1)外源性的叔丁基过氧化氢(t-BHP)在不同浓度梯度(0μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM)作用C2C12成肌细胞的条件摸索,MDA含量测定评价细胞氧化应激水平,从而确定造成氧化应激的t-BHP浓度。(2)外源性t-BHP调控成肌分化进程中线粒体稳态生物节律实验:C2C12成肌细胞分为control组和t-BHP treated组,加入马血清启动成肌分化,t-BHP treated组细胞在分化起始时加入100μM的t-BHP,将分化开始后的48h定义为ZT0,分别在ZT0,ZT4,ZT8,ZT12,ZT16,ZT20和ZT24收集细胞检测相关指标。Western-blotting检测Mfn2,OPA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1蛋白表达水平,荧光定量PCR检测MyoD mRNA表达。(3)线粒体稳态干预实验:C2C12成肌细胞分为4组:空质粒对照组、OPA1 siRNA组;DMSO对照组、Drp1抑制剂组。加入马血清启动成肌分化对C2C12成肌细胞进行分化和叔丁基过氧化氢孵育,在分化开始后的48h定义为ZT0,每4个小时进行细胞收集一次,分别为ZT0,ZT4,ZT8,ZT12,ZT16,ZT20,ZT24。实验分组:control组和t-BHPtreated组;Western-blotting检测Mfn2,OPA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及生物钟Bmal1表达,荧光定量PCR成肌分化MyoD的表达。分化开始时,空质粒对照组加入空白干扰片段,OPA1 siRNA组加入OPA1siRNA干扰片段,DMSO对照组加入DMSO溶液、Drp1抑制剂组加入50μM的Mdivi1。分化48 h时收集细胞检测相关指标。Western-blotting检测OPA1,Drp1及Bmal1蛋白表达。荧光定量PCR检测MyoD和PGC-1α,线粒体力能学检测活性氧和膜电位。研究结果:(1)在外源性t-BHP调控成肌分化进程中线粒体生节律实验中,JTK-CYCLE算法分析结果表明,对照组(MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,Drp1,COXIV,PGC-1α,OMA1及Bmal1)蛋白表达和MyoD的基因水平表达均具有显著生物节律,MnSOD,OPA1,COXIV,PGC-1α,OMA1,S-OPA1,蛋白表达,MyoD的基因水平表达均表现为波峰值显著高于均值(p0.05),Drp1,L-OPA1,OMA1,Drp1及Bmal1的蛋白表达均出现波谷值显著低于均值(p0.05),MyoD的基因水平表达与MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,OMA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1的蛋白水平表达均出现波谷值显著低于波峰值(p0.05)。t-BHP treated组(MyoD的基因水平表达,MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,OMA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1的蛋白表达)未表现显著生物节律,MyoD的基因水平表达,MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,OMA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1的蛋白表达表现为波峰、波谷和均值间比较无显著差异(p0.05)。与对照组比较,t-BHP treated组(MyoD的基因水平表达,MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,OMA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1的蛋白表达的总表达量显著降低(p0.05~0.01)。(2)在线粒体稳态干预实验中,与空质粒组比较,OPA1 siRNA组活性氧是显著升高(p0.05),膜电位(p0.05~0.01),PGC-1α,MyoD的基因水平以及蛋白Bmal1,OPA1,Drp1的蛋白表达水平表达显著降低(p0.05)。与DMSO对照组,Drp1抑制剂组膜电位显著升高(p0.05~0.01),MyoD的基因水平和蛋白Bmal1的水平表达并无显著变化(p0.05),PGC-1α的基因水平和活性氧显著下降(p0.05)。研究结论:1.C2C12细胞成肌分化进程中,线粒体稳态(生物合成、融合/分裂)和成肌分化相关因子表达呈显著生物节律。2.本研究利用外源性叔丁基过氧化氢孵育建立C2C12细胞氧化应激模型,证明氧化应激导致成肌分化进程中线粒体稳态生物节律异常或消失。3.本研究利用OPA1 siRNA和Drp1抑制剂建立C2C12细胞线粒体稳态干预模型,证明线粒体稳态障碍抑制生物钟基因表达,具体机制有待进一步研究。
【图文】：

定性分析,电泳,吸附柱,离心转速

竖直安静 2min，离心转速 1 步骤重复离心，转速为 1 万转，3min，之后重复上述弃掉废液，之后离心两分钟，转速为一万转入吸附柱，在吸附柱的膜中央加入 40 微升 3 分钟后，在冰上静止放置 5 分钟，，放于负性检测糖凝胶电泳电压 110V 36min,每孔加入 6μl图 2-2 所示 28s 和 18s 的带是非常清晰显著紫外分光光度计上检测到波长为260纳米和 OD 值处于 1.7 到 2.1 之间是可以用于逆转

叔丁基过氧化氢,细胞存活率,成肌细胞

图 3-1 叔丁基过氧化氢与细胞存活率关系叔丁基过氧化氢与细胞存活率关系（Mean ± SD. *P<0.05, **P<0.01）浓度梯度（0μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM化氢孵育 C2C12 细胞在 72h 之后处理细胞，发现成肌细浓度的叔丁基过氧化氢在 72h 处理之后，与对照组 0h 相，当 120μM 时出现显著性差异变化，C2C12 成肌细胞受击，增殖活性明显受到抑制，呈现出明显的降低趋势。虽氧化氢没有明显的造成成肌细胞的增殖变化，但是可能造，在 120μM 时出现严重的氧化损伤。（图 3-1）
【学位授予单位】：天津体育学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：G804.6

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