延髓五羟色胺神经元持续内向电流构成及五羟色胺的调控研究

发布时间：2020-07-04 08:06

【摘要】：行进运动(locomotion)是脊椎动物的一种基本运动形式,其主要特点是通过肢体周期性和节律性地运动使躯体产生位移。行进运动由位于中脑的运动中枢(Mesencephalic Locomotor Region,MLR)诱导和控制,由分布于脊髓系统中的神经网络群执行和操作,这个网络群称为中枢模式发生器(Central Pattern Generator,CPG)。研究发现,脑干5-HT神经元对行进运动的引发和形成发挥重要的作用,其原因是由于5-HT神经元所释放的5-HT神经递质在行进运动中扮演着重要的调控作用。持续内向电流(Persistent Inward Current,PIC)作为一种电压门控的离子电流,存在于多种类型的神经元中并具有多种功能。系统研究5-HT神经元中PIC的特性对揭示5-HT神经元在行进运动中的作用具有重要的意义。先前有关PIC的研究大多集中在脊髓中与运动有关的运动神经元和中间神经元,但关于脑干延髓5-HT神经元PIC的电生理特性的系统研究鲜有报道。鉴于此,本文使用ePet-EYFP转基因小鼠模型和全细胞膜片钳技术,系统研究脑干延髓5-HT神经元的PIC电生理特性,并进一步研究神经递质五羟色胺对脑干延髓5-HT神经元PIC的调节作用。研究表明,位于延髓椎体旁侧区域(Parapyramidal Region,PPR)和中缝核群(Midline Raphe Nuclei,MRN)的5-HT神经元PIC均包含有对tetrodotoxin(TTX)敏感的钠离子电流(Na-PIC)和对dihydropyridine(DHP)敏感的钙离子电流(Ca-PIC);五羟色胺对PIC及其不同离子成分的电流具有不同程度的增强性调节作用。本研究有助于我们理解PIC对脑干延髓5-HT神经元兴奋性调控的离子通道机制,加深我们对行进运动内在机制的认识。研究脑干PPR和MRN区域的5-HT神经元的PIC,探究其特性与位置分布的关系以及进一步观察其药理学特性和神经递质的调控特性,有助于提高我们对行进运动产生、协调和控制机制的认识。目的:本文使用ePet-EYFP转基因小鼠模型和全细胞膜片钳技术,研究持续内向电流PIC在脑干延髓PPR和MRN区域5-HT神经元中的电生理特性;探究脑干延髓中表达PIC的5-HT神经元位置分布与PIC电生理特性之间的关系;测试加入阻断剂TTX或DHP后PIC的变化情况;观察神经递质5-HT对脑干5-HT神经元的PIC、Ca-PIC和Na-PIC的调节作用。本研究有助于解释PIC及5-HT系统对运动控制的潜在作用,提高我们对肢体行进运动产生、控制和协调机制的认识。方法:研究采用新生ePet-EYFP转基因小鼠,雌雄不限,鼠龄为出生后1-15天。解剖小鼠获得脑干以制备脑干切片(250微米);在荧光显微镜下寻找EYFP阳性的5-HT神经元。利用全细胞膜片钳技术,在电压钳模式下记录PIC;分析激活电压(V_o)、峰值电压(V_p)、PIC幅度(Amplitude)。研究加入钠通道阻断剂(TTX)或钙通道阻断剂(DHP)后PIC的生物物理学特性变化,包括V_o、V_p、Amplitude等指标,以及神经递质5-HT对不同类型PIC电生理特性的调节。结果:(1)脑干延髓5-HT神经元分布在PPR和MRN区域。(2)本实验共记录195个5-HT神经元,其中169个细胞表达PIC(86.7%)。测试PPR区域的5-HT神经元83个,有70个细胞表达PIC(84.3%),MRN区域5-HT神经元112个,99个细胞表达PIC(88.4%)。(3)实验观察到5-HT神经元表现出5种类型的PIC,分别为:a-PIC(65.5%)、2a-PIC(20.2%)、d-PIC(4.8%)、ad-PIC(7.1%)、3a-PIC(2.%)。(4)PIC的生物物理学参数(n=51):V_o(-19.8±6mV)、V_p(-0.5±3.3mV)、Amplitude(220.8±81.9pA)。按位置划分PIC:椎体旁侧的5-HT神经元PIC(n=19):V_o(-17.4±3.7mV)、V_p(1.3±2.5mV)、Amplitude(210.6±68.4pA)。中缝核群的5-HT神经元PIC(n=32):V_o(-19.5±7.3m V)、V_p(-0.7±4.2mV)、Amplitude(213.4±86pA)。PPR和MRN区域5-HT神经的PIC在V_o、V_p和幅度上均没有显著性差异(P0.05)。(5)PIC由电压敏感的钠电流(Na-PIC)和电压敏感的钙电流(Ca-PIC)两种电流组成。实验条件下,在记录PIC的溶液中加入1—2μM TTX可得Ca-PIC。其中在所测的10个5-HT神经元中,PIC的V_o(-15.7±5.8 mV)、V_p(3.2±6.5 mV)、Amplitude(268.2±123.8 pA),加入TTX后Ca-PIC的V_o(-15.5±2.9 mV)、V_p(0.8±7mV)、Amplitude(225±102 pA)。实验条件下,加入20—30μM DHP可得Na-PIC。在所测的15个5-HT神经元中,PIC的V_o(-17.7±5.4 mV)、V_p(-0.8±4.3mV)、Amplitude(270.8±75.4pA),加入DHP后Na-PIC的V_o(-17.2±3.7mV)、V_p(-2.3±2.8mV)、Amplitude(204±48.2 pA)。加入TTX或者DHP降低电流幅度及去极化激活电压。但结果表明:同一个细胞的PIC与Na-PIC及Ca-PIC在电流幅度上存在显著性差异(P0.05)。(6)5-HT对PIC的调节(n=9):实验所用的5-HT浓度为15—20μM。5-HT增加PIC幅度从185.2±71.5 pA到271.4±91.5 pA(P0.05),激活电压V_O超极化从-19.7±7.5 mV到-23.6±7.2 mV(P0.05)。5-HT对椎体旁侧5羟色胺神经元PIC的调节更为显著(n=4),主要体现在激活电压和电流幅度(P0.05)。5-HT对中缝核群5-HT神经元PIC的电生理调节无显著性变化(P0.05,n=5)。(7)5-HT对Na-PIC的调节(n=9):5-HT增加Na-PIC的幅度从201.6±62pA到287±64.1pA,但与对照组比较没有显著性差异(p0.05)。激活电压超极化从-17.8±3.2mV到-22.3±1.9mV,且与对照组比较具有显著性差异(p0.05)。5-HT对Ca-PIC的调节(n=14):5-HT增加Ca-PIC的幅度从194.3±91.2pA到258.3±149pA(p0.05),激活电压从-20.8±5mV到-24.3±8.9m V(p0.05)。结论:(1)在ePet-EYFP小鼠脑干延髓5-HT神经元中,PIC是普遍表达的且与分布位置(PPR、MRN)无关,PIC包含有对tetrodotoxin(TTX)敏感的钠离子电流(Na-PIC)和对dihydropyridine(DHP)敏感的钙离子电流(Ca-PIC)。(2)椎体旁侧(PPR)和中缝核群(MRN)的5-HT神经元PIC电生理特性没有显著性差异,但PPR区域的5-HT神经元对神经递质5-HT的调节更为敏感,这一特性可能与PPR位置的5-HT神经元在行进运动中的重要作用有关。(3)作为中枢系统中一种重要的神经递质,本研究显示5-HT可增加PIC幅度,超极化激活电压,表明5-HT可提高神经元兴奋性。这种神经调控机制可能在行进运动中扮演重要作用。(4)5-HT可增强脑干延髓5-HT神经元的Ca-PIC和Na-PIC,且调节机制不同。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：G804.2
【图文】：

参数计算

在计算 PIC 的各种电生理参数前，从记录得到的 PIC 图可用于分析。在给予电压的上升支引发的 PIC 用于计算持续内向电黑色线代表原始图形，红色线为处理过电流曲线。渗漏电流减后，电直线，其与水平线轨迹相切的最后一点定义为产生 PIC 的起始点：应的电压为 V0。电流曲线的最低点定义为 PIC 的峰值：IP，其所对幅度定义为 IP与 I0的差值，即 PIC=I0-IP。标记细胞胞电生理测试的同时，向记录电极内注入 0.5 1% 黄色yellow ）用于标记 5-HT 神经元。电生理实验结束后，将标片放置于 4%的多聚甲醛溶液中浸泡 2 小时，之后用 PB净，再移至载玻片到自然风干，最后用荧光固化剂处理切

示意图,脑干,标本,示意图

实验中用于计算生物物理学参数的 PIC 图像的选取标准：电流幅度>20pA，胞渗流电流<100pA，干扰小，PIC 曲线比较稳定即震荡小。本文主要分为三大分，首先描述 5-HT 神经元在脑干分布以及 PIC 在 5-HT 神经元不同区域的表状况。其次，根据 PIC 组成成分的不同，通过加入钠通道阻断剂 TTX 或钙通阻断剂 DHP 将 PIC 进一步划分为 Ca-PIC 和 Na-PIC，并研究不同类型 PIC 的生理特性。最后，探究神经递质 5-HT 对 PIC、Ca-PIC、Na-PIC 的调节作用。1 脑干 5-HT 神经元的分布本文研究的是脑干下行 5-HT 神经元，主要是指脑干延髓区域的 5-HT 神经，即 a-b 之间的脑干组织（图 2 为脑干标本示意图）。实验条件下将脑干延髓行振动切片，大致可切 4-5 片（每片厚度 250μM）。将切片放置于荧光显微下，可观察到脑干延髓的 5-HT 神经元分布在 PPR 和 MRN 区域（图 3）。

【参考文献】