负重爬梯运动与LIPUS联合干预对去卵巢大鼠骨质疏松的改善作用及其机制研究

发布时间：2020-10-30 17:27

　　 目的:随着人口老龄化的逐渐加剧,骨质疏松的发病率将逐年上升,预计到2050年中国的骨质疏松患者将达到2.12亿人。由骨质疏松引发的慢性疼痛、骨折及活动受限给患者及社会带来了巨大的负担。如何预防骨质疏松的发生及有效治疗骨质疏松发生后的并发症是各个领域学者亟待解决的问题。抗阻力运动是刺激骨代谢的一种主要运动方式,抗阻力运动可以增加对骨的应力刺激,改善骨代谢水平,刺激骨形成。目前,许多学者的研究结果表明,抗阻力运动对骨组织及骨质疏松的防治有积极作用,但鲜有人研究长期规律的抗阻力运动对骨质疏松后骨损伤的愈合是否有促进作用。关于抗阻力运动对防治骨质疏松的作用机制亦不明确。低强度脉冲超声(LIPUS)是一种物理刺激,在临床应用中具有无创伤、非侵入性、操作方便、无副作用的优点。在临床治疗骨折和骨延迟愈合中,LIPUS已被广泛应用。但LIPUS在骨质疏松防治中的作用仍然存在争议。LIPUS对骨作用的机制尚不完全明确。肌肉和骨骼在解剖结构及生理代谢方面有着紧密联系,最近研究表明,肌肉分泌的负向调控因子肌肉生长抑制素(MSTN)对骨骼有着重要影响,MSTN缺失会对骨骼产生积极作用。因此,本实验通过去卵巢构建骨质疏松大鼠模型,去卵巢后对大鼠进行负重爬梯运动干预,干预结束后大鼠右侧股骨钻取1.0 mm双侧穿透的孔,构建骨损伤模型,并给予LIPUS干预。从MSTN基因入手,探讨负重爬梯运动和LIPUS干预对骨质疏松及骨损伤的影响及其分子机制。以期为预防骨质疏松及治疗骨损伤提供理论层面的依据。方法:3月龄健康雌性SD大鼠85只,随机分为:假手术组(Sham Operation,Sham)和去卵巢组(Ovariectomized,OVX)。OVX组进行双侧卵巢切除手术,Sham组保留卵巢只切除卵巢旁同等大小的脂肪。去卵巢2w后待大鼠伤口恢复,将OVX大鼠随机分为:去卵巢对照组(Ovariectomized,OVX),去卵巢负重爬梯组(Ovariectomized + Exercise,OEX),去卵巢超声干预组(Ovariectomized +Ultrasound,OUS),去卵巢负重爬梯 LIPUS 联合干预组(Ovariectomized + Exercise+ Ultrasound,OEU)。使用实验室自主专利产品对OEX组和OEU组进行6 d/w,持续10 w的递增负荷负重爬梯运动干预,爬梯高1m,倾斜角度为85°,每级阶梯间隔2 cm。Sham组、OVX组和OUS组不予运动干预。10 w后Sham组和OVX组各取6只大鼠,OEX组和OEU组各取3只大鼠处死,留取血清和组织以待检测。其余大鼠,对右侧股骨进行骨损伤模型构建,模型构建成功后,OUS组和OEU组进行LIPUS治疗干预,每天干预20 min,每周干预6 d,持续3 w。使用双能X射线检测大鼠股骨骨密度,ELISA法检测大鼠血清雌激素和MSTN表达,使用比色法检测血清碱性磷酸酶和血清抗酒石酸性磷酸酶含量,使用Micro-CT对大鼠股骨远端及骨损伤区域进行扫描分析,使用三点弯曲力学测试系统检测大鼠股骨的力学性能,使用HE染色法对大鼠股骨干骺端进行形态学观察,使用RT-qPCR和Weatern blot法检测大鼠股骨远端及股四头肌MSTN和Wnt信号通路关键分子的表达,以分析探讨负重爬梯运动和LIPUS作用于骨的生物学机制。结果:1.大鼠体重、抓力、骨重、股四头肌重量和骨密度结果:与Sham组相比,OVX大鼠体重显著增加(P0.01),抓力降低(P0.05),股四头肌重减轻(P0.05);与OVX组相比,OEX组股四头肌重量(P0.05)和抓力(P0.01)显著增加。进行负重爬梯运动5 w后OEX组大鼠体重开始显著低于OVX组(P0.05)。BMD检测结果显示,与Sham组相比,OVX组和OEX组BMD显著降低(P0.01);与OVX组相比,OEX组BMD显著增高(P0.05)。钻孔损伤3 w后,与Sham组相比,OVX、OEX、OUS、OEU各组的抓力均显著降低(P0.01),而OVX、OEX、OUS、OEU各组间比较并无显著性差异。运动和LIPUS干预均显著增加了肌肉重量(P0.01),股骨重量在各组间无显著性变化。2.大鼠血清指标检测结果:负重爬梯运动显著抑制了去卵巢大鼠血清Tracp活性(P0.05),增加了血清ALP和E2含量(P0.05),但在骨损伤停止运动3 w后对ALP和E2的显著影响消失。骨损伤后LIPUS干预,显著降低了血清Tracp活性(P0.01),增加了 ALP活性(P0.01)。损伤前进行运动和LIPUS治疗联合干预对血清ALP和Tracp的作用效果要优于两者单独干预。LIPUS单独干预对血清E2无显著影响。3.大鼠股骨远端显微结构测试结果:去卵巢后12 w,Micro-CT三维重建图像显示,OVX大鼠松质骨骨小梁数量明显减少,骨小梁间隙明显增大,分离度增加,负重爬梯运动显著改善了去卵巢大鼠松质骨结构。定量分析结果显示,OVX组的 BMD、BV/TV、Tb.N 与 DA(P0.01)均显著低于 Sham 组,而 Tb.Sp(P0.01)显著高于 Sham 组;与 OVX 组相比,OEX 组 BMD、BV/TV、Tb.N 与 DA(P0.05或0.01)均显著提高,Tb.Sp(P0.01)显著降低;各组间Tb.Th值无显著性差异。骨损伤3 w后,运动对大鼠骨显微结构的改善作用依然存在。LIPUS干预治疗后,与OVX组相比,OUS和OEU组BMD、Tb.N、Tb.Th(P0.01或P0.05)均显著增高,Tb.Sp显著降低(P0.05),而BV/TV和DA与OVX组无显著变化;OEX、OUS、OEU三组之间数据结果无显著性差异。4.大鼠股骨损伤愈合结果:大鼠股骨损伤处的二维和三维重建图显示:OVX与Sham组相比,骨愈合明显延迟,体现在钻孔后第10天较少的新骨生成和钻孔后第21天皮质缺损部位较低的复原率。与OVX组相比,OEX、OUS和OEU组均显现出较好的骨愈合趋势,体现在钻孔后第10天较多的新骨生成,钻孔后第21天较好的皮质缺损部位桥接。定量分析钻孔后21 d时损伤部位的愈合度,OVX组愈合度显著低于Sham组(P0.01),而OEX、OUS和OEU组孔愈合度均显著高于 OVX 组(P0.01)。5.大鼠股骨生物力学测试结果:负重爬梯运动显著改善了大鼠结构力学性能(P0.01或P0.05),对材料力学性能无显著改善作用。钻孔损伤后,OVX组股骨力学性能各项指标依然显著低于Sham组,与OVX组相比,OEX组极限载荷和能量吸收显著增高(P0.01),而刚度和弹性模量与其无显著差异。OUS组和OEU组,各项指标均显著增高(P0.01或P0.05),但OEX、OUS和OEU三组之间无显著差异。6.大鼠血清和股四头肌MSTN表达结果:负重爬梯运动显著抑制了去卵巢大鼠血清MSTN和股四头肌MSTN表达(P0.01),这一抑制效应在停止运动3 w后依然存在。骨损伤后,LIPUS干预显著降低了血清MSTN含量和股四头肌MSTN表达(P0.01)。负重爬梯运动和LIPUS联合干预的效果要优于LIPUS单独作用效果(P0.05)。7.MSTN和Wnt信号通路关键分子表达结果:10 w负重爬梯运动显著抑制了MSTN 下游分子 ACTRIIB、Smad2/3、P-Smad3 及 GSK-3β mRNA 水平和蛋白表达量,促进了 Wntl和β-catenin基因和蛋白表达。在骨损伤并进行3wLIPUS干预治疗后,与 OVX 组相比 LIPUS 显著抑制了 ACTRIIB、Smad2/3、P-Smad3 及 GSK-3βmRNA水平和蛋白表达量,促进了 Wnt1和β-catenin mRNA和蛋白水平表达量。两者联合作用对Gsk-3βmRNA和蛋白水平、Wnt1 mRNA水平的作用效果优于单独作用的效果。结论:1.负重爬梯运动可有效地抑制去卵巢导致的骨代谢失调、骨量丢失、骨微结构紊乱和骨生物力学性能下降,这一改善状况在运动停止3 w后未完全消失。2.前期负重爬梯运动显著促进了大鼠股骨损伤愈合速度,在骨损伤后施加LIPUS干预亦可显著加速骨损伤的愈合、改善股骨显微结构、增强股骨的力学性能。两者联合干预对骨代谢指标的作用效果优于两者单独干预,但两者联合干预对股骨显微结构、孔愈合度和生物力学性能的影响与两者单独干预无显著差异。3.负重爬梯运动和LIPUS干预抑制骨量流失和改善骨微结构,加速骨愈合的潜在机制可能是通过抑制MSTN信号通路中ActrIIB、Smad2、Smad3等信号分子的表达,进而调节β-catenin、Gsk-3β等关键信号分子的表达,激活Wnt/β-catenin信号通路,抑制骨吸收,加速骨形成。但因本实验未进行信号通路关键基因阻断实验研究,尚不能得出确切结论,仍需后续实验研究支持说明。
【学位单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R580;G804.2
【部分图文】：

作ｌｃｍ直切口，用剪刀将皮肤和皮下筋膜剪开，在竖脊肌的边缘剪开腹肌，用镊??子支撑打开腹腔，看见脂肪后小心将其提出，找到粉红色卵巢后缝扎下方血管及??脂肪、子宫，切除卵巢，逐层缝合肌肉和皮肤，用碘伏消毒伤口（如图１所示）。对??随机选取的２０只假手术组大鼠，保留卵巢，只将卵巢旁同等体积的脂肪切除。实??验中有５只大鼠不能适应麻醉剂量死亡，从麻醉中清醒过来的大鼠，没有出现伤??口感染全部存活。??２．２．３骨损伤模型构建??本实验参考Ｃｈｅｎｇ等［１３３］构建模型的方法构建本实验骨损伤模型。在大鼠去卵??巢后１２?ｗ，负重爬梯运动干预结束后进行骨损伤模型构建。模型构建中使用的所??有器械均经过高压或酒精消毒灭菌处理。手术中的麻醉手段，选择３％的戊巴比妥??１７??

暴露出股骨，选取好位置后，固定好股骨，用１．０ｍｍ的钻头进行打孔，保证??钻头垂直穿过股骨。用灭菌处理的生理盐水将股骨及伤口中的骨屑冲出，用消毒??后浸润生理盐水的缝合针线逐层缝合切口，损伤模型构建效果如图２所示。为了??预防手术后感染，在大鼠伤口处仔细用浸润碘伏的棉签涂抹。该骨损伤模型无需??任何固定措施，不影响大鼠的正常活动，大鼠在ｌ－２ｄ后皆可自由活动。钻孔完成??２４?ｈ后正位Ｘ线片观察患肢，观测骨损伤的状况，要求无骨折现象发生，伤口无??感染。??二：－、餐?Ｘ、??图１去卵巢骨质疏松模型构建过程??自??Ｕａ??图２大鼠损伤孔Ｍｉｃｒｏ－ｃｔ重建图示。（Ａ）大鼠右侧股骨整体图示，（Ｂ）骨钻孔损伤处三??维图示，（Ｃ）骨钻孔损伤处二维图示。??１８??

去卵巢后两周，待大鼠伤口基本愈合后，使用实验室自主专利产品对ＯＥＸ组和??ＯＥＵ组进行６ｄ／ｗ的尾部负重爬梯运动，爬梯高ｌｍ，倾斜角度为８５°，每级阶梯??间隔２?ｃｍ?（图３?Ａ）。前２?ｗ大鼠进行３组／ｄ，?５次／组，组间休息２?ｍｉｎ的负重运??动，负重量为３５％自身体重；训练第３周至第６周大鼠负重量增加为５０％自身体??重、３组／ｄ、７次／组、组间休息２?ｍｉｎ；第７周至第１０周大鼠负重量为自身体重的??７０％、３组／ｄ、１０次／组、组间休息２?ｍｉｎ。其余大鼠不进行运动千预。１０?ｗ后Ｓｈａｍ??组和ＯＶＸ组各取６只大鼠，ＯＥＸ组和ＯＥＵ组各取３只大鼠处死，留取血清和组??织以待检测。其余大鼠，对右侧股骨进行骨损伤模型构建，模型构建成功后，ＯＵＳ??组和０￡１］组进行［１？１３３治疗干预，每天干预２〇１１１丨１１，６＜１＾，持续３？，超声波治??疗仪的超声波强度为３０?ｍＷ／ｃｍ２，占空比为２０％，超声波中心频率为１．５?ＭＨｚ，??脉冲频率为丨ｋＨｚ［９４］（图３?Ｂ）。??癒羅??图３运动装置和超声治疗仪器。（Ａ）负重爬梯训练装置；（Ｂ）超声治疗仪。??１９??
【参考文献】

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本文编号：2862786