TGF-β-Smad信号通路相关细胞因子在小鼠非酒精性脂肪肝干预中的差异表达

发布时间：2017-04-20 00:12

  本文关键词：TGF-β-Smad信号通路相关细胞因子在小鼠非酒精性脂肪肝干预中的差异表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的:探讨有氧运动训练和中药干预对高脂膳食诱导下小鼠非酒精性脂肪肝形成的抑制作用,初步揭示有氧运动训练和中药对改善小鼠非酒精性肝脏损伤的机制,并探讨相关细胞因子的关联作用。研究方法:实验对象及分组:KM种雄性小鼠80只,体重18~22g,室温23℃到25℃自然光照饲养。实验小鼠购入后,通过高糖高脂膳食灌胃建立小鼠非酒精性脂肪肝模型。每天固定时间进行灌胃,每日1次(下午13时),每周6次。通过5周灌胃构建小鼠非酒精性肝损伤模型。建模结束后随机选取模型小鼠5只,取新鲜肝组织进行HE染色,检验细胞中脂滴着色情况。从造模成功所有小鼠中,淘汰伤病小鼠,保留60只。随机分成5组,每组12只,各组分别为:阴性对照组(OJ)、阳性对照组(Y)、中药组(M)、有氧运动组(E)、中药联合有氧运动组(E+M)。实验方案:有氧运动干预采用水平动物跑台方式,前3天为适应性跑台训练,每次30min,速度8m/min。第4-6天运动时间逐渐递增至60min,速度12m/min(Pm15:00-17:00),维持此运动量持续训练7周,每周训练6次,运动训练时驱赶停止不动的小鼠已达到额定训练负荷。中药干预的最佳有效剂量通过按人和小鼠的体表面积折算得出等效剂量,并通过口灌胃进行干预,灌胃前配备成0.5ml灌胃(药剂浓度为0.2Λg/g)。中药联合运动组剂量:按200ml/kg体重在实验前配备成所需要浓度进行灌服给药(总体积0.5ml)。阴性对照组、跑台组采用相同时间灌服同体积生理盐水进行干预,阳性对照组主要使用水飞蓟宾悬浮液进行灌服,每次灌胃剂量按人与小鼠体表面积折算0.5ml/次(相当于人体用药的20倍)。所有需要进行灌胃干预的小鼠均灌服7周,每周6次。实验期间记录小鼠的行为学变化。7周干预实验结束后,小鼠禁食过夜,随后将肝组织从体内剥离进行取材,对各个干预组的小鼠肝脏组织情况采用显微结构形态学观察,评价各个干预小组的小鼠肝组织损伤情况;通过免疫组化检测法来评定小鼠肝组织tgf-β1生长因子的蛋白表达水平情况;rt-pcr法检测肝组织中smad3、smad4mrna表达程度;血生化检测分析血清谷草转氨酶(ast)、丙氨酸转氨酶(alt)、甘油三酯(tg)、以及总胆固醇(tc)、和超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)在血清中的含量水平。研究结果:(1)he染色显示:阴性对照组脂肪病变程度最为明显,小鼠肝细胞内出现大量纤维化增生,肝细胞发生变性情况严重,有大面积细胞病变坏死出现,细胞内部结构变形排列混乱;有氧运动组与阴性对照组肝脂肪病变程度进行比较评分有降低;任可见少量肝细胞纤维化,肝细胞变性情况;中药干预组和运动干预组与阴性对照组相比,肝组织细胞任然有较少病变细胞分布出现,肝小叶组织结构有所改变,但肝细胞排列结构欠整齐;阳性干预组和中药联合运动干预组较阴性组对比,肝组织无明显坏死情况,肝小叶组织结构基本正常,肝细胞排列较整齐。(2)血清学结果:通过单因素方差分析法,将有氧运动组、中药组、阳性对照组和有氧运动联合中药组与阴性对照组分别进行两两比较,可知在不同的干预方式下小鼠血清中ALT、AST和TG、TC、SOD、MDA水平较阴性组都有不同程度降低(P0.05)。与阴性组对比有氧运动联合中药组能明显降低高脂饮食小鼠肝脏中丙二醛(MDA)的含量的趋势,(p0.01),从而使肝脏MDA含量进一步降低。与阴性组相比有氧运动训练联合中药组,有显著提高高脂膳食大鼠肝脏氧化物歧化酶(SOD)的活性作用(p0.01)。中药联合有氧运动组与阴性对照组相比ALT、AST和TG、TC检测指标有明显下降趋势(P0.05)说明两者间有协同作用,ALT,AST、TG、TC的活性表达程度是进一步降低了。(3)免疫组化检测显示:各干预小组中TGF-β1生长因子蛋白表达水平均低于阴性对照组,其中以中药联合有氧运动组蛋白表达水平差异最大(P0.01)。(4)RT-PCR结果显示:通过检测,小鼠肝组织中smad3、smad4 mRNA表达水平由高到低排名依次为:阴性对照组、有氧运动组、阳性组、中药组以及中药联合有氧运动组。其中中药联合有氧运动组表达水平最低(P0.01)。结论:通过中等强度有氧运动同时和中药配合干预,能较大程度改善小鼠非酒精性脂肪肝中TGF-β-Smad信号转导通道相关细胞因子的表达,增强非酒精性肝损伤小鼠的免疫功能,使小鼠非酒精性脂肪肝损伤得以改善,为临床治疗提供有力依据。
【关键词】：中药 有氧运动 非酒精性肝损伤 TGF-β smad3 smad4
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：G804.2
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-14
• 1 前言14-18
• 2 实验材料与方法18-24
• 2.1 实验对象18
• 2.2 主要试剂与仪器18-20
• 2.2.1 主要试剂18-19
• 2.2.2 主要仪器19-20
• 2.3 实验方法20-23
• 2.3.1 实验对象分组及模型的构建20
• 2.3.2 给药方案20
• 2.3.3 运动方案20
• 2.3.4 样品采集与处理20-21
• 2.3.5 病理学观察与血清学指标检测21
• 2.3.6 免疫组化21-22
• 2.3.7 Realtime-PCR检测TGF-β1、Smad3、Smad4 mRNA的表达22
• 2.3.8 质量控制22-23
• 2.4 统计学分析23-24
• 3 实验结果24-32
• 3.1 一般情况24
• 3.2 肝脏形态学观察24-25
• 3.2.1 模型制备情况24-25
• 3.2.2 运动和药物干预阶段后25
• 3.3 血生化指标25-32
• 3.3.1 肝指数变化25-26
• 3.3.2 各干预组对NAFLD小鼠肝组织中SOD、MDA的含量水平以及变化影响26-27
• 3.3.3 各干预组对NAFLD小鼠血液中SOD、MDA的含量水平以及变化影响27-28
• 3.3.4 肝功能变化28
• 3.3.5 血液TC、TG变化28-29
• 3.3.6 各小鼠肝组织TGF-β免疫组化检测29-30
• 3.3.7 Realtime PCR结果30-32
• 4 讨论32-37
• 4.1 非酒精性脂肪肝与TGF-β信号通路相关因子32-34
• 4.1.1 非酒精性脂肪肝的发病机制32
• 4.1.2 TGF-β家族在NAFLD中的调节作用32
• 4.1.3 Smad蛋白在TGF-β信号通路中的影响机制32-33
• 4.1.4 TGF-β信号通路在对抗肝纤维化中的机制作用33-34
• 4.2 有氧运动或中药对NAFLD的干预效应34-35
• 4.3 有待进一步研究的问题35-37
• 5 结论37-38
• 参考文献38-41
• 综述41-51
• 参考文献48-51
• 致谢51-52

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