MiR-206和miR-486及其相关调节因子在卫星细胞增殖、分化中的变化

发布时间：2017-08-14 13:23

  本文关键词：MiR-206和miR-486及其相关调节因子在卫星细胞增殖、分化中的变化

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【摘要】：研究目的骨骼肌损伤是运动训练及日常生活中常见的损伤之一,但骨骼肌自我修复能力有限,在专业性运动员中,肌肉的反复损伤会引起肌肉炎症,甚至出现肌肉纤维化,肌肉收缩能力下降,从而影响运动能力。肌肉损伤后,处于基膜和肌膜之间静息状态下的卫星细胞会被激活,并通过增殖、分化等方式,相互融合成多核的肌管,修复损伤或坏死的肌纤维,从而修复受损的骨骼肌。而卫星细胞的激活、增殖和分化过程中相关调节因子的变化还不是很清晰。以往的研究中主要用C2C12成肌细胞系来研究卫星细胞的激活、增殖和分化,但用原代卫星细胞来研究卫星细胞的增殖及分化的比较少,用原代卫星细胞来模拟细胞的生长状态将更接近于活体研究。Micro RNA-206(mi R-206)和micro RNA-486(mi R-486)是在骨骼肌中特异性高表达的mi RNAs,而它们在卫星细胞中的表达及其作用还不是十分清晰。本研究从SD乳鼠提取卫星细胞,分为正常培养组和诱导分化组,比较两组间或同组不同时间点mi R-206和mi R-486及其相关因子Pax7和Myf5的表达状况,探究卫星细胞增殖、分化过程中mi R-206和mi R-486及相关调节因子的表达变化,为丰富和进一步完善肌肉再生理论提供新的实验依据,进而为骨骼肌损伤提供有效的新思路和手段具有重要意义。研究方法选用7日龄SD乳鼠,乙醚麻醉后75%酒精浸泡消毒,断头处死,取腓肠肌和比目鱼肌,解剖镜下迅速剥离脂肪、筋膜等组织;充分剪碎后用II型胶原酶、胰酶两步消化法释放卫星细胞,胎牛血清终止消化;采用差速贴壁法来纯化肌卫星细胞。取3~5代卫星细胞进行干预,实验分成两组:正常培养组(GM组,高血清培养)、诱导分化组(DM组,低血清培养)。进行以下检测:1、采用免疫细胞化学染色检测横纹肌肌动蛋白(α-SCA)的表达,对卫星细胞的纯度进行鉴定。2、采用酶联免疫法检测正常培养和诱导分化第5天卫星细胞MHC的表达变化,对比卫星细胞正常培养和诱导分化后第5天的生长状况。3、采用PT-PCR检测第1,2,3,5天正常培养组和诱导分化组卫星细胞中Pax7、Myf5 m RNA的变化以及骨骼肌特异性mi R-206和mi R-486的变化。4、采用Western Blot检测Pax7、Myf5蛋白水平的变化。为保证实验的可靠性,实验的每一步均需取不同批次的细胞重复三遍。研究结果1、卫星细胞横纹肌肌动蛋白(α-SCA)免疫化学染色,免疫阳性为卫星细胞,实验结果显示卫星细胞纯度较高。2、酶联免疫检测结果显示,诱导分化组在第5天MHC表达比正常培养组高,说明诱导分化组分化程度比较高。3、PCR结果1)正常培养组中,Pax7 m RNA的表达逐渐下降,第2、3、5天表达低于第1天,且有显著性差异(P0.05)。诱导分化组表达逐渐下降,但无显著性差异。两组同时间点之间无显著性差异。2)正常培养组中,Myf5 m RNA的表达逐渐下降。诱导分化组中不同时间点之间无显著性差异。正常培养组中,Myf5 m RNA在各个时间点都高于诱导分化组,但在统计学上无显著性差异。3)Mi R-206在正常培养组和诱导分化组表达都先下降,再略微上升。但同组各个时间点之间无显著性差异。4)Mi R-486在在正常培养组和诱导分化组中表达与mi R-206表达大致相同,先下降,再略微上升。但同组各个时间点之间无显著性差异。4、Western Blot实验:1)正常培养组和诱导分化组Pax7蛋白的表达情况,结果显示,正常培养组Pax7蛋白表达呈逐渐下降趋势,和第1天相比,第5天Pax7蛋白的表达显著下降(P0.05)。诱导培养组中,Pax7蛋白表达呈逐渐下降趋势,和第1天相比,第3、5天Pax7蛋白的表达显著下降(P0.05)。两组同时间点间无显著性差异。2)正常培养组和诱导分化组Myf5蛋白的表达情况,结果显示,正常培养组和诱导分化组Myf5蛋白表达都呈逐渐下降趋势,但无显著性差异。结论1.通过两步酶消化法和差速贴壁法提取的卫星细胞具有增殖、分化的能力。卫星细胞在高血清培养基中,细胞汇合度到达一定程度时也会向细胞分化方向发展。2.在卫星细胞分化过程中,Pax7蛋白和Myf5蛋白表达下降,且Pax7促进Myf5的表达。3.Mi R-206和mi R-486在不同培养基中出现的峰值不同,在增殖培养基中mi R-206和mi R-486在第3天表达最高,而在分化培养基中mi R-206和mi R-486在第1天表达最高。推测mi R-206和mi R-486在卫星细胞融合成肌管初期表达上升。
【关键词】：卫星细胞 miR-206 miR-486 Myf5 Pax7
【学位授予单位】：上海体育学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：G804.7
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文缩略词表9-12
• 1 前言12-13
• 2 文献综述13-19
• 2.1 Micro RNA-206的生物合成和作用机制13-14
• 2.1.1 Micro RNAs的生物合成13
• 2.1.2 Micro RNA-206的作用方式和调节机制13-14
• 2.2 Micro RNA-206在疾病中的表达14-15
• 2.2.1 Micro RNA-206在骨骼肌疾病中的表达14-15
• 2.2.2 Micro RNA-206在其他疾病中的表达15
• 2.3 Micro RNA-206在骨骼肌损伤和运动中的研究15-18
• 2.3.1 Micro RNA-206在肌肉损伤中的研究15-16
• 2.3.2 Micro RNA-206在运动中的研究16-18
• 2.4 Micro RNA-206的研究展望和应用18-19
• 3 研究方法和实验步骤19-26
• 3.1 实验对象19
• 3.2 实验分组19
• 3.3 技术路线19-20
• 3.4 实验的主要仪器与设备20
• 3.5 主要试剂20
• 3.6 主要实验试剂配制20-21
• 3.7 骨骼肌卫星细胞原代培养方法21
• 3.8 骨骼肌卫星细胞纯度鉴定方法21
• 3.9 骨骼肌卫星细胞诱导分化方法21
• 3.10 骨骼肌正常培养、诱导分化后生长状况鉴定方法21-22
• 3.11 骨骼肌培养中micro RNA-206及其相关指标的测定方法22-25
• 3.11.1 RT-PCR的流程22-25
• 3.11.2 Western blot法检测mi RNAs及相关基因蛋白表达25
• 3.12 数据处理25-26
• 4 实验结果26-31
• 4.1 大鼠卫星细胞的形态学观察26-27
• 4.2 大鼠卫星细胞的鉴定27-28
• 4.3 卫星细胞正常培养、诱导分化生长状况28
• 4.4 在正常培养组和诱导分化组mi R-206、mi R-486、Pax7 m RNA及Myf5m RNA的表达情况28-30
• 4.5 正常培养组和诱导分化组Pax7和Myf5蛋白表达情况30-31
• 5 讨论分析31-37
• 5.1 大鼠骨骼肌卫星细胞增殖、诱导分化模型的建立31-33
• 5.1.1 大鼠骨骼肌卫星细胞的提取31-32
• 5.1.2 诱导分化培养基的选择32
• 5.1.3 卫星细胞纯度的鉴定32-33
• 5.1.4 卫星细胞分化的鉴定33
• 5.2 正常培养组出现分化现象分析33-34
• 5.3 卫星细胞正常培养组和诱导分化组pax7的变化特征34
• 5.4 卫星细胞正常培养组和诱导分化组Myf5的变化特征34-35
• 5.5 卫星细胞正常培养组和诱导分化组mi RNA-206和mi RNA-486的变化特征35-37
• 6 结论37
• 7 参考文献37-42
• 致谢42

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