MGF调控骨骼肌卫星细胞的迁移及ERK在其中的作用

发布时间：2017-09-11 05:24

  本文关键词：MGF调控骨骼肌卫星细胞的迁移及ERK在其中的作用

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【摘要】：研究目的骨骼肌损伤现象在人们日常体育活动中是很常见的,但其愈合效果往往不理想,原因是骨骼肌的自我修复有诸多的局限性,于是,如何使骨骼肌能够更快速而且高质量地愈合,成了运动医学和分子生物学领域迫切需要解决的问题和从事体育运动人群的关注焦点。在骨骼肌受损时,肌卫星细胞开始发挥举足轻重的作用,它经过自身的增殖、迁移等行为,影响着骨骼肌的再生。以往关于MGF迁移通路的研究比较少见。本研究通过离体培养骨骼肌卫星细胞,在MGF干预下联合使用PD98059(Erk1/2)抑制剂,探究MGF调控骨骼肌卫星细胞迁移的信号传导通路。实验方法取体重为110g左右的SD大鼠(雄性)1只,在清洁无菌的条件下提取比目鱼肌和腓肠肌,充分剪碎后用两步酶消化法消化肌肉释放细胞;接着进行两次差速贴壁去除大部分成纤维细胞及其他细胞;台盼蓝拒染法检测所得细胞活性率;使用细胞免疫染色法来进行鉴定。取传代至三代的细胞用45ng/ml的人工合成MGF进行干预,实验分组:C组、MGF组、MGF+PD组,每组分别干预24、48、72、96h,用CCK-8实验测肌卫星细胞的增殖能力;使用Transwell法测其迁移率;Western Blot测各组Erk1/2蛋白表达情况。实验结果1、台盼蓝拒染法:细胞着色数量为17个,未被着色细胞数为483个。本次实验细胞活性率为(500-17)÷500x100%=96.6%(大于95%)符合实验要求。2、免疫化学染色结果:横纹肌肌动蛋白表达呈阳性。3、CCK-8结果:检测的骨骼肌卫星细胞增殖的OD值,比较C组和MGF组的数据表明,MGF组在24、48、72、96h增殖的OD值均非常显著高于C组(P0.01)。4、Transwell结果:a.MGF组结果显示,48、72h组的骨骼肌卫星细胞迁移的OD值非常显著高于24h组细胞(P0.01),96h组OD值也显著高于24h组(P0.05)。b.比较MGF组与MGF+PD组的数据表明,在24、48、72、96h组中,MGF组与MGF+PD组骨骼肌卫星细胞迁移的OD值均没有显著性差异(P0.05)。5、Western Blot结果:使用Western Blot测P-Erk1/2在MGF组和MGF+PD组的表达,结果显示MGF+PD组在培养24、48、72h时P-Erk1/2表达量非常显著低于MGF组(P0.01),MGF+PD组培养96h时P-Erk1/2的表达量也低于MGF组(P0.05)。结论1.外源性MGF能促进骨骼肌卫星细胞的增殖,而且对其增殖的影响具有时效关系,最佳时间点为72h,在24-72h范围内促进细胞增殖效果呈逐渐上升趋势,在72-96h范围内呈下降趋势。2.外源性MGF能促进骨骼肌卫星细胞的迁移,而且骨骼肌卫星细胞的增殖能力可能会影响其迁移效果。3.ERK抑制剂(PD)对骨骼肌卫星细胞迁移效果的影响无统计学意义,提示MGF可能不是通过MAPK/ERK1/2信号通路影响骨骼肌卫星细胞迁移的。
【关键词】：机械生长因子 肌卫星细胞 增殖 迁移信号通路
【学位授予单位】：上海体育学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：G804.7
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 前言11
• 2 文献综述11-17
• 2.1 骨骼肌的损伤及修复11-12
• 2.2 IGF-I对骨骼肌再生修复的影响12
• 2.3 MGF的发现和命名12-13
• 2.4 MGF的功能13
• 2.5 骨骼肌卫星细胞13
• 2.6 骨骼肌卫星细胞的激活13-14
• 2.7 骨骼肌卫星细胞的增殖和分化14-15
• 2.8 细胞的迁移15
• 2.9 信号通路与细胞迁移15-16
• 2.10 ERK及MAPK/ERK信号转导通路16-17
• 3 研究对象与方法17-25
• 3.1 研究对象17
• 3.2 实验技术路线17-18
• 3.3 实验的主要仪器名称18
• 3.4 主要实验试剂18-19
• 3.5 主要实验试剂配制方法及步骤19-20
• 3.6 骨骼肌卫星细胞的原代、传代培养20
• 3.6.1 原代培养20
• 3.6.2 传代培养20
• 3.7 骨骼肌卫星细胞的活性检测方法——台盼蓝拒染法20-21
• 3.8 骨骼肌卫星细胞的纯度鉴定21-22
• 3.9 MGF影响骨骼肌卫星细胞增殖的测定方法22
• 3.9.1 实验分组22
• 3.9.2 CCK-8 法增殖测定22
• 3.10 MGF影响骨骼肌卫星细胞迁移的测定方法22-23
• 3.10.1 实验分组22
• 3.10.2 Transwell法迁移测定22-23
• 3.11 Western Blot实验检测蛋白表达23-25
• 3.11.1 蛋白样本制备23
• 3.11.2 BCA法蛋白定量23
• 3.11.3 SDS-PAGE电泳23-25
• 3.12 统计学处理25
• 4 实验结果25-33
• 4.1 骨骼肌卫星细胞活细胞计数25
• 4.2 骨骼肌卫星细胞的形态变化特征25-27
• 4.3 骨骼肌卫星细胞的纯度鉴定27-28
• 4.4 MGF干预下骨骼肌卫星细胞的增殖变化28
• 4.5 MGF组和MGF+PD组不同时间节点的肌卫星细胞迁移结果28-31
• 4.5.1 MGF组和MGF+PD组迁移效果图比较28-29
• 4.5.2 MGF组和MGF+PD组的肌卫星细胞迁移结果比较29-31
• 4.6 Western Blot实验结果31-33
• 4.6.1 Erk1/2 蛋白的表达31-32
• 4.6.2 P- Erk1/2 蛋白的表达32-33
• 5 讨论33-36
• 5.1 高纯度骨骼肌卫星细胞的提取33
• 5.2 细胞培养基的选择和使用33-34
• 5.3 卫星细胞鉴定34
• 5.4 不同增殖能力的骨骼肌卫星模型的建立34-35
• 5.4.1 MGF干预浓度的选择34
• 5.4.2 MGF干预时间的设定34-35
• 5.5 MGF对肌卫星细胞迁移的影响35
• 5.6 Erk1/2 对肌卫星细胞迁移的影响35-36
• 6 结论36-37
• 7 参考文献37-41
• 8 致谢41

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