解烃菌TY22的解烃特性及其烷烃羟化酶基因的克隆

发布时间：2017-10-17 18:21

  本文关键词：解烃菌TY22的解烃特性及其烷烃羟化酶基因的克隆

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【摘要】：石油是目前全世界最为重要的能源物质,但在其开发和使用过程中,往往会泄漏或排放出大量石油烃污染物而造成严重的环境污染。随着污染情况日益加剧,高效且不产生二次污染的石油烃微生物修复技术现已成为该领域研究的热点,烷烃羟化酶作为启动整个降解过程的关键酶,也成为了研究的焦点。本研究以从南充炼油厂周围被石油污染的土壤中筛选出的一株高效石油烃降解菌TY22为研究对象,经鉴定,该菌株归属于Acinetobacter beijerinckii,最适生长温度和pH分别为30℃、7.0,能降解C12~C32的正构烷烃。由于微生物的生长和代谢与环境中的金属离子密切相关,本文研究了15种金属离子对TY22烷烃降解的影响。结果表明,低浓度的Na~+、Mg~(2+)、K~+、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)对TY22菌株的生长和烷烃降解有一定的促进作用,但Ca~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)的促进作用较小,且当它们超过最适浓度后,菌体生物量快速减少;Fe~(3+)、Ti~(4+)对TY22菌株的生长和烷烃降解有一定的抑制作用,但低浓度的Fe~(3+)对其影响不大,且当它们的浓度达到1 mmol/L时,菌株仍具有一定的生长潜力;Al~(3+)、Pb~(2+)对TY22菌株的生长和烷烃降解有很强的抑制作用,当其浓度达到0.8mmol/L时,菌体生物量已下降至0.1以下;Ba~(2+)、Ag~+、Ni~(2+)对TY22菌株的生长和烷烃降解有极强的抑制作用,当它们的浓度达到0.1 mmol/L(Ba~(2+)达到0.4mmol/L)时,菌体生物量几乎为零。本文还研究了TY22菌株的烷烃羟化酶基因alkB。以TY22基因组DNA为模板,PCR扩增得到了TY22菌株烷烃羟化酶基因的部分序列。再通过染色体步移(Chromosome Walking)技术,最终获得了1236 bp的烷烃羟化酶基因完整CDS序列(GenBank Accession:KU867870)。经分析,该基因编码一段411 aa的蛋白,相对分子量46.7 kDa,等电点9.22。BLAST比对后发现,该序列与多株Acinetobacter beijerinckii的烷烃羟化酶氨基酸序列存在极高的同源性,最高可达99%。预测其二级结构包括37.47%的α螺旋,10.71%的β转角,35.28%的无规则卷曲和16.55%的延伸链。进一步将TY22的alkB基因与pET21b(+)载体构建重组质粒,并转入E.coli BL21(DE3)进行表达。结果发现,重组菌在0.1 mM IPTG、30℃条件下诱导培养6h的表达效果最佳,所得的46 kDa蛋白也与预期理论值相符。再将alkB基因克隆至pCom8载体中,并分别转入E.coli GEc137(pGEc47△B)和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1进行基因功能的互补试验。结果发现,TY22菌株的烷烃羟化酶能氧化C12~C16的中长链烷烃。
【关键词】：石油烃降解菌 金属离子 烷烃羟化酶 表达 功能互补
【学位授予单位】：西华师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X172;Q78
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 主要符号对照表10-11
• 第一章 前言11-18
• 1.1 石油污染物11-12
• 1.1.1 石油的组成11
• 1.1.2 石油污染物的危害11-12
• 1.2 石油污染的微生物修复12-13
• 1.2.1 石油烃降解菌的种类12-13
• 1.2.2 微生物降解石油烃的代谢途径和机理13
• 1.2.3 环境条件对微生物修复的影响13
• 1.3 烷烃羟化酶研究进展13-16
• 1.4 烷烃羟化酶的应用16-17
• 1.5 本研究的内容、目的及意义17-18
• 第二章 不同金属离子对解烃菌TY22烷烃降解的影响18-28
• 2.1 实验材料18-19
• 2.1.1 菌株18
• 2.1.2 主要试剂18
• 2.1.3 培养基18
• 2.1.4 常用溶液18-19
• 2.1.5 主要仪器设备19
• 2.2 实验方法19-20
• 2.2.1 菌种的活化与纯化19
• 2.2.2 降解实验19
• 2.2.3 菌体生物量的测定19-20
• 2.3 结果与分析20-27
• 2.3.1 轻金属离子对解烃菌TY22烷烃降解的影响20-23
• 2.3.2 重金属离子对解烃菌TY22烷烃降解的影响23-27
• 2.4 本章小结27-28
• 第三章 烷烃羟化酶基因alkB的克隆及序列分析28-47
• 3.1 实验材料28-29
• 3.1.1 菌株与载体28
• 3.1.2 主要试剂28
• 3.1.3 培养基28
• 3.1.4 常用溶液28-29
• 3.1.5 主要仪器设备29
• 3.2 烷烃羟化酶基因alkB片段的克隆29-38
• 3.2.1 引物29-30
• 3.2.2 实验方法30-33
• 3.2.3 结果与分析33-38
• 3.3 染色体步移技术测定烷烃羟化酶基因alkB全序列38-41
• 3.3.1 实验方法38-40
• 3.3.2 结果与分析40-41
• 3.4 序列分析41-45
• 3.4.1 DNA序列BLAST分析41-42
• 3.4.2 氨基酸序列BLAST分析42-43
• 3.4.3 蛋白理化性质分析43
• 3.4.4 蛋白二级结构、三级结构的预测43-45
• 3.5 本章小结45-47
• 第四章 烷烃羟化酶基因alkB在大肠杆菌中诱导表达47-57
• 4.1 实验材料47-48
• 4.1.1 菌株与质粒47
• 4.1.2 主要试剂47
• 4.1.3 培养基47
• 4.1.4 常用溶液47-48
• 4.1.5 主要仪器设备48
• 4.2 实验方法48-52
• 4.2.1 聚合酶链式反应（PCR）48-49
• 4.2.2 重组菌的构建49-51
• 4.2.3 重组菌的诱导表达51-52
• 4.3 结果与分析52-56
• 4.3.1 alkB基因的PCR扩增52-53
• 4.3.2 阳性克隆的鉴定53-54
• 4.3.3 重组菌的诱导表达54-56
• 4.4 本章小结56-57
• 第五章 烷烃羟化酶基因alkB的缺失与互补功能验证57-66
• 5.1 实验材料57-59
• 5.1.1 菌株57
• 5.1.2 质粒57
• 5.1.3 主要试剂57-58
• 5.1.4 培养基及常用溶液58
• 5.1.5 主要仪器设备58-59
• 5.2 实验方法59-62
• 5.2.1 聚合酶链式反应（PCR）59
• 5.2.2 重组菌的构建59-62
• 5.2.3 重组菌的功能互补实验62
• 5.3 结果与分析62-65
• 5.3.1 alkB基因的PCR扩增62-63
• 5.3.2 阳性克隆的鉴定63-64
• 5.3.3 重组菌的功能互补实验64-65
• 5.4 本章小结65-66
• 第六章 结论与展望66-68
• 6.1 结论66-67
• 6.2 展望67-68
• 参考文献68-74
• 附录 A pet21 系列载体图谱及相关序列位点74-75
• 致谢75-78
• 在学期间的科研情况78

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