假单胞菌DLL-E4中pnp基因簇LysR家族调控因子分析
本文关键词：假单胞菌DLL-E4中pnp基因簇LysR家族调控因子分析 出处：《南京农业大学》2015年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：对硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)是化工领域中相当重要的有机合成中间体,被广泛应用于化工染料、医药、农药等精细化学品的合成。PNP可经皮肤、呼吸道、消化道等被身体吸收,对人类的生产、生活以及健康带来巨大影响。自19世纪以来,研究者已从环境中分离出来自不同种属的降解PNP的微生物资源,如今关于PNP的微生物代谢更多集中在分子机制上的研究,但关于PNP调控机制的报道相对较少。Pseudomonas putida DLL-E4是本实验室从长期受有机磷农药污染的土壤中分离出的一株高效降解PNP的菌株。P.putida DLL-E4中有两套PNP代谢基因簇(pnp),目前本实验室已经研究并报道了 LysR家族调控蛋白PnpR在PNP代谢调控中的作用。由pnpR进行基因沉默的方式表明pnpR以正调控的方式调控pnp基因簇的下游对苯二酚(HQ)代谢相关基因(pnpC1C2DE),但是PnpR对pnp中的脱硝基类相关基因即pnpBA无调控作用。单组分黄素单加氧酶PnpA是P.putida DLL-E4中PNP代谢的起始酶,将PNP降解HQ,其转录和翻译情况对菌株代谢PNP速率有决定性影响,因此本实验通过不同的手段筛检菌株DLL-E4中脱硝基类相关调控基因。本研究以P.putida DLL-E4作为实验材料,利用转座子插入失活法筛选PNP降解性能丢失的突变菌株。在排除pnpA基因突变的情况下,获得2株突变株J1、J4不能降解PNP。利用SEFA-PCR扩增突变子两侧侧翼序列,找到转座子插入位点,扩增 J1 插入位点下游 1998bp,插入位置在 cyclopropane-fatty-acyl-phospholipid synthase编码区,这是一个环丙烷脂肪酰基磷脂合成酶。J4插入位点为5230809,该位置编码new RNA_214,该RNA调控PNP的降解。以P.putida DLL-E4作为实验材料对其进行全基因组框架图测序,结果表明菌株DLL-E4的基因组长度约为6.43M,GC含量约62.44%,共计190个Scaffold,223个Contig。利用生物信息学相关软件MUMmer对Contigs进行排列,Glimmer 3.0进行开放性阅读框(ORFs)预测,NCBI数据库NR库数据进行功能注释,得到DLL-E4的CDS功能信息,并且通过Local Blast对其中的LTTRs进行同种间的比较,试图从生物信息学得方法获得pnpA的转录调控因子。从已经报道pnp基因簇中的LTTRs进行分析,发现P.putida DLL-E4基因组中的OPR_3566与多个PNP降解菌株的调控因子氨基酸序列同源性较高。对菌株DLL-E4和DLL-AR中的OPR_3566进行单交换插入失活,结果表明ORF_3566缺失菌株降解PNP降解性状丧失。结合转录组数据分析,在PNP诱导后的菌株中ORF_3566会出现明显表达。因此该ORF_3566可能为pnpAB的调控基因pnpABR目前对于pnpR作用于两套HQ代谢基因簇的调控尚不明确,本研究对DLL-AR中pnpC1、pnpC1b基因通过同源重组的方法进行沉默,获得突变菌株DLL-dpnpC1、DLL-dpnpC1b。结果表明两个突变株菌均不能有效降解HQ,只能部分转化,从DLL/AR-dpnpC1、DLL/△R-dpnpC1b的降解状况基本相同可以认为,当其中一个基因沉默后另第一套的pnpC1行使功能,即可认为两套HQ代谢基因簇均行使功能。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X172;Q78
【参考文献】
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