高效DEHP降解菌的分离鉴定及降解基因的研究

发布时间：2018-01-30 01:57

本文关键词： DEHP Gordonia sp.HS-NH1 pht基因簇 HPLC　出处：《华中师范大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：邻苯二甲酸二(2乙基己基)酯(DEHP)属于邻苯二甲酸酯类(PAEs,又名酞酸酯),是一种环境激素类化合物。DEHP广泛应用于食品包装材料、化妆品、农药、医疗器械、以及儿童玩具等领域,是一种广泛应用的增塑剂。DEHP在塑料制品中不以共价键连接,因此极易从塑料中脱离进入环境,目前已经广泛存在于土壤,水体以及大气等外界环境中。DEHP具有生物富集作用,且对有机体造成生殖毒性,神经毒性,及多器官癌变等伤害,因此被美国环保局(EPA)列入优先控制有毒污染物的行列。环境中的DEHP可通过生物和非生物两种主要方式降解,其中微生物降解是最主要的降解方式。目前关于DEHP微生物降解的研究主要集中在降解菌的筛选,鉴定及其降解特性分析,而关于DEHP的代谢途径及其功能基因的研究却很罕见。本文从长期受生活污水污染的湖北省武汉市南湖底泥中分离筛选得到一株高效DEHP降解菌HS-NH1,经鉴定是戈登氏菌(Gordonia sp.),并对其进行降解特性、代谢途径及其部分功能基因研究。戈登氏菌属(Gordonia sp.)是一类重要的环境污染物降解菌,而关于Gordonia sp.对DEHP的降解机制的研究却很罕见。本研究通过富集培养法筛选得到4株DEHP降解菌,经梯度驯化发现一株降解效率高,底物范围广的DEHP降解菌,命名为HS-NH1。通过16SrRNA和gyrB基因同源序列分析及分子系统发育树的构建,结合形态学观察和生理生化实验,初步鉴定该菌为戈登氏菌(Gordonia sp.)。Gordonia sp.HS-NH1的最适生长和降解温度为30℃、pH值为7.0,最适条件下,该菌株能够在60h内将500mg/LDEHP降解90%以上。底物广谱性试验证明,Gordonia sp.HS-NH1能够有效地利用多种常见的邻苯二甲酸酯(PAEs)及其代谢产物,如邻苯二甲酸丁基苄基酯BBP、邻苯二甲酸二辛酯DOP、邻苯二甲酸二丁酯DBP、邻苯二甲酸二乙酯DEP、邻苯二甲酸二甲酯DMP、邻苯二甲酸PA、原茶儿酸PCA等。本文通过高效液相色谱(HPLC)检测DEHP的代谢产物,在DEHP降解初期,邻苯二甲酸(PA)大量积累,并随着降解时间的延长而逐渐减少。结果表明PA是DEHP降解的重要代谢产物,且PA的降解也是DEHP彻底降解的关键步骤,因此Gordoniasp.HS-NH1中PA降解相关基因的分离和鉴定是探究DEHP具体代谢途径的必要环节。本文对Gordoniasp.HS-NH1进行基因组扫描分析,得到5073开放阅读框,并对其基因注释和基因功能分类,发现DEHP降解相关基因有邻苯二甲酸酯水解酶基因,MEHP水解酶基因,邻苯二甲酸降解基因簇(pht基因簇,包括基因phtAa、phtAb、phtAc、phtAd、phtB、phtC、phtR),原儿茶酸降解基因簇(pcm基因簇,包括基因pcmF、pcmR、pcmD、pcmH、pcmG、pcmB 和pcmL),ABC 转运蛋白基因簇(ptr基因簇,包括ptrB、ptrD和ptrA),MFS转运蛋白基因等遗传单位,并对其进行生物信息学分析,发现这些遗传单位与NCBI中其他DEHP降解菌中的相应基因都具有同源性。其中pht基因簇负责DEHP重要中间代谢产物PA的降解,其编码的氨基酸序列分别与其他菌株的3,4-邻苯二甲酸双加氧酶大亚基(phtAa)、3,4-邻苯二甲酸双加氧酶小亚基(phtAb)、3,4-邻苯二甲酸双加氧酶铁氧还蛋白亚基(phtAc)、3,4-邻苯二甲酸双加氧酶铁氧还蛋白还原酶亚基(phtAd)、3、4-二氢二羟邻苯二甲酸脱氢酶(phtB)、3、4-二羟邻苯二甲酸脱羧酶(phtC)和调控蛋白(phtR)的氨基酸序列具有高度的相似性。反转录PCR结果显示,Gordnia sp.HS-NH1中的pht基因簇形成一个操纵子,由PA诱导共同转录。本文通过PCR技术分离得到pht基因簇的基因片段:phtAab、phtAcd、phtB、phtC、通过分子克隆技术将这些基因亚克隆到pET-28a中,构建重组表达载体pET-phtAcd、pET-phtB和pET-phtC,并将重组表达载体转入受体细胞E.coliBL21中,构建重组菌。SDS-PAGE分析重组菌的诱导表达产物,结果显示含有重组质粒pET-phtAab的重组菌表达大小约为53-kDa、22-kDa的两个蛋白;含有重组质粒pET-phtAcd的重组菌表达大小约为7-kDa、43-kDa的两个蛋白;含有重组质粒pET-phtB的重组菌表达大小约为30-kDa的蛋白;含有重组质pET-phtC的重组菌表达大小约为25-kDa的蛋白,这些蛋白大小与生物软件(DNAMAN7.0)根据氨基酸序列预测的大小基本一致。HPLC检测表达产物催化活性,结果显示PA在phtAab、phtAcd的表达产物共同催化下转化成3,4-二氢二羟邻苯二甲酸,后者在phtB、phtC的表达产物共同催化下转化成原儿茶酸。因此可以推测DEHP的代谢途径是:DEHP在邻苯二甲酸酯水解酶的作用下水解产生邻苯二甲酸,邻苯二甲酸在pht基因簇表达的多种酶作用下形成原儿茶酸,原儿茶酸最终在多种酶作用下形成CO_2和H_2O。综上所述,Gordoniasp.HS-NH1是一株降解效率高,底物范围广的DEHP降解菌,Gordonia sp.HS-NH1基因水平的研究为深入理解其降解途径,提高其降解效率,扩大其降解污染物范围奠定基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X172

【参考文献】