白鲢p38 MAPK,c-fos,c-jun基因克隆及其微囊藻毒素暴露后的表达分析

发布时间：2018-03-22 02:24

本文选题：白鲢　切入点：微囊藻毒素　出处：《河南师范大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是细胞内重要的信号转导分子,参与生物体多种生理和病理过程的调节。p38 MAPK是MAPK通路的重要成员之一,它可被细胞内生长因子、细胞因子和胞外多种刺激(环境压力、紫外线、放射线、热休克、炎症因子、特定抗原等)所活化,并参与细胞内多种信号传递过程。原癌基因c-fos、c-jun、c-myc属即刻早期基因(Immediately Early Genes,IEGs)成员。目前已发现的IEGs有十几种,其中c-fos、c-jun基因被广泛用作外界刺激后神经元活化的标记,在细胞活动中起着重要的调控作用。本研究首次克隆了白鲢肝脏p38 MAPK、c-fos和c-jun基因cDNA全长并进行了序列分析,同时检测了微囊藻毒素(Microcystins,MC)对白鲢的急性毒性作用及其腹腔注射染毒后白鲢肝脏和肾脏p38 MAPK、c-fos、c-jun和c-myc的表达分析。本研究利用RT-PCR和RACE技术扩增得到p38 MAPK、c-fos、c-jun基因的cDNA全序列。序列分析结果表明,白鲢肝脏p38 MAPK基因序列全长2 418 bp,开放阅读框1 086 bp,编码361个氨基酸;c-fos基因序列全长为1 719 bp,开放阅读框1 059 bp,编码352个氨基酸;c-jun cDNA全长1 931 bp,开放阅读框927 bp,编码308个氨基酸。生物信息学分析发现,白鲢p38 MAPK蛋白相对分子质量为41.64 kD,理论等电点为5.54,该蛋白是一个不稳定蛋白,具有较强的亲水性。c-Fos蛋白相对分子质量为38.242 kD,理论等电点为4.93,该蛋白是一个不稳定蛋白且具有较强的亲水性。c-Jun蛋白相对分子质量为33.928 kD,理论等电点为9.08,是一个不稳定蛋白且具有一定的亲水性。二级结构预测显示,p38 MAPK包含45.71%α-螺旋、13.02%的延伸链、4.99%的β-折叠和36.29%的无规则卷曲;c-Fos包含25.85%的α-螺旋、12.78%的延伸链、1.42%的β-折叠和59.94%的无规则卷曲;c-Jun包含32.14%的α-螺旋、5.52%的延伸链、1.62%的β-折叠和60.71%的无规则卷曲。对其功能结构位点分析发现,p38 MAPK在35~309 aa之间存在一个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶区;c-Fos和c-Jun分别在108~172 aa和227~291 aa处有一个典型的亮氨酸拉链结构。通过构建氨基酸系统发育树显示,白鲢p38 MAPK与鲤鱼同源性高达96%,白鲢c-Fos与草鱼c-Fos同源性高达97%,白鲢c-Jun与草鱼c-Jun同源性高II达95%,与哺乳动物同源性相对较低。另外,qPCR检测结果显示p38 MAPK、c-fos和c-jun在白鲢各个组织均有表达,其中p38 MAPK表达量高低依次是肌肉肠脾肾鳃肝心脑;c-fos表达量高低依次是肝脾肾肠肌肉鳃脑心;c-jun表达量高低依次是肝肠心脑脾肾肌肉鳃。通过上下增减剂量法(up and down procedure,UDP)对白鲢进行MC急性毒性实验,结果显示,MC对白鲢48 h LD50为520μg·Kg-1。根据半致死剂量选取50和200μg·Kg-1浓度组MC腹腔注射暴露白鲢,分别于1、3、8和12 h后取材白鲢肝、肾组织,提取RNA,通过qPCR检测白鲢p38 MAPK、c-fos、c-jun和c-myc基因的表达变化,结果表明,MC对其表达都有明显的诱导作用,推测白鲢p38 MAPK、c-fos、c-jun和c-myc可能与MC肝毒性和肾毒性相关。本研究发现,MC可激活白鲢肝脏p38 MAPK通路及其下游原癌基因c-fos、c-jun、c-myc,推测MC诱发肝炎/肝癌可能通过该信号通路介导。该研究结果为深入研究MC诱发肝炎、肝癌的分子机制,寻找MC毒作用新的分子靶点和肝病防治药物靶点提供理论依据。
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【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4;X52

【参考文献】