污水处理系统及受纳河水中噬菌体在耐药基因水平转移中的作用

发布时间：2020-03-25 08:46

【摘要】：耐药细菌所携带的耐药基因可以通过质粒、转座子、整合子等可移动元件传递给其它环境微生物,从而导致耐药基因的传播和扩散。目前对耐药基因转移机制的研究多集中在质粒、转座子、整合子,对噬菌体在耐药基因传播中的贡献了解甚少。噬菌体是一类细菌病毒的总称,是生态系统中丰度最高的生物,广泛分布于湖泊、海洋、以及生物体内等一切有微生物存在的地方。噬菌体在河流、海洋、污水等自然环境中介导基因转移已经被证实,其作为可移动元件在基因转移和基因重组中的作用频率比人们预想的要高。但是,目前对噬菌体基因组携带抗生素耐药基因以及在抗生素耐药基因水平传播中的作用机制研究却十分有限。本研究从城市污水处理厂分离得到一株多重耐药细菌的噬菌体,对其生理生化性质及全基因组进行研究;随后,我们又对新乡市卫河水体中细菌和噬菌体宏基因组中耐药基因的种类和丰度进行了研究;最后,我们通过实验室模拟实验研究了噬菌体在水体环境中耐药基因水平转移中的作用。获得如下创新性成果:(1)从新乡市骆驼湾城市污水处理厂分离获得50株多重耐药菌株,以此为宿主共分离到一株噬菌体YZ1,其宿主为Escherichia coli XX13(MG735731.1),该宿主对庆大霉素、环丙沙星、红霉素、四环素、阿莫西林-克拉维酸、万古霉素、甲硝唑、头孢噻肟均具有耐药性。经透射电镜观察,噬菌体YZ1为短尾科噬菌体,头部直径约为45 nm,尾部长度大约为3nm。噬菌体YZ1的最佳感染复数MOI=0.01,在0-40℃范围内其生物活性稳定;在pH4.0-8.0之间噬菌体均可保持活性。一步生长曲线结果显示,噬菌体YZ1潜伏期为20 min,裂解期约50min。YZ1为一线性双链DNA分子,基因组全长38823bp,GC含量50.37%(GenBank登录号为:MG845865)。NCBI比对结果表明噬菌体YZ1属于T7 like噬菌体,噬菌体YZ1全基因组与E.coli phage K1F在结构和序列上有95%相似性。所预测到的ORF序列经NCBI比对(e-value10~(-5)),得到42个有功能注释的ORF,其功能类型主要与DNA复制、噬菌体结构、转录以及溶原性相关。在基因组原始数据中有28段序列比对到了氨基糖苷类、β-内酰胺类、喹诺酮类等抗生素的耐药基因。后续的荧光定量PCR结果显示,噬菌体和宿主菌的DNA样品中均含有aacC2、aac(6')-Ib、aadA、sul2、blaCTX-M耐药基因,但tetT只在宿主菌中被检测到。(2)选用250对耐药基因引物利用高通量荧光定量PCR技术对卫河水体MYH取样点进行细菌和噬菌体宏基因组上耐药基因检测,结果表明,噬菌体宏基因组上检测到50个耐药基因,包括氨基糖苷类9种、FCA类5种、β-内酰胺类5种、MLSB类9种、万古霉素类6种、四环素类4种、未知机制的12种;细菌宏基因组检测到173对引物的耐药基因,包括氨基糖苷类28种、FCA类20种、β-内酰胺类35种、MLSB类16种、万古霉素类9种、四环素类24种,磺胺类3种,插入序列7种,未知机制的31种。基于该结果,利用qPCR技术对卫河新乡市市区段六个水体取样点的噬菌体和细菌宏基因组进行耐药基因丰度研究,结果表明,tetX、ereA、aac(6')-Ib基因在六个取样点的噬菌体和细菌的宏基因组中均检测到,丰度分别为10~1-10~3copies/L和10~5-10~(10)copies/L,但是blaCTX-M1在MYH、WHB两个取样点的噬菌体宏基因组中并未检出。(3)为了验证噬菌体在耐药基因转移中的作用,构建了实验室无菌培养体系,在含120株分离自卫河水体的混合细菌的4个培养器中分别加入3.6×10~6 pfu/ml噬菌体原液、抗生素(终浓度为2μg/ml四环素和2μg/ml阿奇霉素复合药液)、噬菌体+抗生素、对照(无抗生素和噬菌体)。经过连续20天培养,各个培养器中耐四环素和耐阿奇霉素的菌株丰度均增加,添加噬菌体原液的反应器中耐四环素和阿奇霉素的细菌丰度高于不加噬菌体原液的反应器,约为对照反应器的10倍,添加抗生素的反应器中耐药菌细菌的丰度也明显上升;基因检测表明,抗生素的加入对tet X、tetW、tetA、tetO、ereA、blaCTX-M、sul1基因有明显的富集作用;噬菌体加入促进了tetX、ereA、qnrA的富集,但并未促进tetO、tetA、tetW、ermA、ermB、blaCTX-M、sul1、qnrA基因的富集。对培养20天的反应器中细菌进行高通量测序研究其中的细菌群落,结果表明,添加噬菌体的培养器中物种的多样性明显高于不加噬菌体的培养器。
【图文】：

结果.1 多重耐药细菌与噬菌体的分离本实验共分离到 50 株多重耐药菌株，以此 50 株菌作为宿主菌，利用双层法分离噬菌体，，共得到一株噬菌体，宿主为大肠杆菌，命名为 Escher13(MG735731.1)，其对应的噬菌体命名为 YZ13（MG845865），通过透射电知，噬菌体 YZ1 为短尾科噬菌体，头部直径大约为 45nm，尾部长度大约为-1。

图 2-1 噬菌体 YZ13 噬菌斑及微观形态2.4.2 宿主菌药敏实验药敏实验结果如图 2-2 所示，该宿主对庆大霉素、环丙沙星、红霉素、四环素、阿莫西林-克拉维酸、万古霉素、甲硝唑、头孢噻肟均具有抗性。由此我们可以确定该菌株为多重耐药菌株。
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X703

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1 李文舒;龚书s

本文编号：2599684