江汉平原典型养殖池塘氨氧化微生物多样性分析

发布时间：2020-04-05 09:35

【摘要】：池塘养殖是我国淡水养殖的主要方式,但在养殖过程中由于大量使用配合饲料造成了池塘中氮素的大量富集。养殖池塘中氮的去除主要依赖于微生物主导的硝化/反硝化过程,其中氨氧化微生物(AOB-氨氧化细菌和AOA-氨氧化古菌:AOB-ammonia oxidizing bacteria,AOA-ammonia oxidizing archaea)参与的氨氧化过程是其限速步骤。本文在优化氨氧化微生物氨单加氧化物酶(amoA)基因扩增条件的基础上,对江汉平原5个典型养殖池塘(标记为B1、B2、B3、B4、B5)水体和沉积物不同分层中的氨氧化微生物进行了研究,并结合水质和沉积物性质分析,研究了氨氧化微生物在养殖池塘中的垂直分布特征及影响因素,以期为养殖池塘中氮素的调控提供理论依据。本文主要的研究结果如下:1.利用控制变量法,针对PCR扩增中出现的杂带、拖带及非特异性扩增等问题,在不同的模板浓度、退火温度、循环次数以及是否添加腐殖酸抑制剂条件下探索了PCR扩增的最佳条件。结果显示在退火温度设置为58℃、循环次数为32时有利于PCR扩增。当扩增含有腐殖酸较多的模板时,加入一定量的BSA可以提高Taq酶的活性,并有助于提高扩增效率。2.在养殖池塘中,水柱中仅检测出AOA,而未检测到AOB,而在沉积物中可以同时检测出AOA和AOB,养殖池塘水柱中AOA是主要的氨氧化微生物。在克隆测序中,所挑取的克隆数的基因覆盖率达90%以上,检测出的OTU序列均不多,但是AOB amoA基因和AOA amoA基因的丰度较高,多样性指数比较低。在97%相似度的水平上,水柱中检测到的AOA amoA基因的OTU有14个,沉积物中AOA amoA基因的OTU有18个,沉积物中AOB amoA基因的OTU序列有15个。在养殖池塘中,水柱中的OTU数目少于沉积物中的OTU,但水柱中和沉积物中的AOA amoA基因OTU序列均隶属于Nitrososphaera cluster、Nitrosopumilus cluster和Nitrososphaera sister group,但是水柱中的OTU序列主要属于Nitrososphaera cluster,而沉积物中的大多数OTU序列属于Nitrososphaera sister group。沉积物AOB amoA基因OTU序列均匀分布在β亚纲的Nitrosomonas和Nitrosospira,不存在γ亚纲Nitrosococcus种群。氨氧化微生物的丰度和多样性结果显示,AOB amoA基因和AOA amoA基因的丰度较高,多样性指数比较低。水质和沉积物的性质对氨氧化微生物的影响分析结果显示,水质与水柱中AOA amoA基因的丰富和多样性并未存在显著相关性,同时水质和沉积物中的AOB amoA基因的丰度和多样性也不存在显著的相关性,但是水体的pH和溶解氧与沉积物中的AOB amoA基因的Shannon-Wiener指数呈显著的正相关,而氨氮的浓度与沉积物中的AOB amoA基因的丰度呈显著负相关。沉积物的pH和微生物量碳(MBC)对沉积物中的AOA amoA基因的丰度有一定的影响,pH和Simpson指数呈显著的负相关,MBC与Shannon-Wiener指数呈显著性的正相关。沉积物中硝氮浓度与水体的AOA amoA基因的丰度呈显著性负相关,氨氧化速率与水柱中AOA amoA基因的丰度呈显著性的正相关,酸性磷酸酶活性与水柱中AOA amoA基因的Simpson指数呈显著的正相关。3.沉积物的不同分层的8个样品中,7个样品中可以挑出较多的AOA amoA基因的克隆子进行分析,聚类分析显示,底层沉积物的AOA amoA基因更为相似,而表层和中层的AOA amoA基因更相似,在97%相似度的水平上,AOA amoA基因的OTU序列有22个,在B4和B5池塘沉积物中,表层和中层的优势种群一致,而底层的优势种群相同;AOA种群较未分层更为丰富,Nitrosotalea cluster仅存在分层沉积物中。仅有5个样品可以挑出较多的AOB amoA基因的克隆子进行分析,聚类分析显示,除表层沉积物的AOB amoA基因更为相似外,整体上看B4和B5沉积物的AOB amoA基因存在较大差异;在97%相似度的水平上,AOB amoA基因的OTU序列有12个,AOB amoA基因的优势种群是Otu 01,占总克隆数的70.8%,除B1b的优势种群是Otu 02外,B1s的优势种群不突出,其他各点的优势种群均是Otu 01。AOB分类与未分层的一致,但是分层中Nitrosospira为优势种群。相关性分析显示沉氨氮的浓度与AOA amoA基因的丰度呈显著的负相关(P0.05),酸性磷酸酶的活性与AOA amoA基因的Shannon-Wiener指数呈极显著的负相关,与Simpson指数呈显著的正相关。β-葡萄糖苷的活性与AOB amoA基因的Simpson指数呈显著的负相关,亚硝氮的浓度与与AOB amoA基因Simpson指数呈极显著的负相关。
【图文】：

中的存在形态主要有：惰性的 N2、最低氧化态的氨(包括 NH3、NH+4、R-N高氧化态的 NO-3。不同形态的氮可以通过固氮作用、氨化作用、硝化作用化作用等相互转化，并与各系统中的氮相互交换，以此构成了复杂的氮循（图 1-1）[1,2]，而驱动氮循环主要是微生物。随着农业尤其是养殖业的快速污染已经成为亟待解决的关键问题。而氮的去除主要是由微生物通过硝化

以长江流域的样品 C1 为例，将沉积物 DNA 分别稀释 2 倍、5 倍、10 倍、2倍、50 倍和 100 倍，反应体系 25μl：包括 12.5μl DreamTaq Green MasterMix (2x)10μM amoA-1F/amoA-2R 各 1μl，，1μl 模板 DNA，补 ddH2O 至 25μl。扩增条件：95℃30s；40cycles（95℃，5s；54℃，40s；72℃，70s）；80℃，20s。并设置一组阴性对照，其电泳图如图 2-1 所示。由图可见，模板 DNA 不经稀释，PCR 扩增效率
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X172;X714

【参考文献】

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本文编号：2614846