鸡舍内有害气体氨气对鸡脾脏免疫毒性的研究

发布时间：2020-04-13 09:26

【摘要】：氨气是一种具有刺激性气味的有害气体,通常可以在集约化养鸡场鸡舍内检测到较高浓度的氨气。尽管氨气的毒性是众所周知的,但氨气中毒(特别是脾脏等免疫器官)的机制研究很少。为了评价氨气对鸡的免疫毒性和研究氨气诱导的鸡脾脏炎症损伤以及细胞自噬的机制,本研究建立了鸡氨气中毒模型,采用qRT-PCR和western blot分别检测了三个水平(miRNA、mRNA和蛋白)上的变化。通过对鸡脾脏组织显微以及亚显微结构的观察和对氧化应激和能量代谢相关因子、Th1/Th2平衡相关细胞因子、炎症相关因子、自噬相关因子以及热休克蛋白水平的检测,探讨氨气引起的肉鸡氧化应激、能量代谢紊乱、炎症损伤、细胞自噬和热休克蛋白代偿性升高的机制。135只1日龄商品代罗斯308肉鸡随机分成对照组、中氨组和高氨组,每组45只鸡。每组肉鸡自由采食标准商品日粮和饮用水,其中对照组氨气浓度1-6周为≤5 mg/m~3;中氨组氨气浓度1-3周为10±1 mg/m~3,4-6周为15±1 mg/m~3;高氨组氨气浓度1-3周为20±1 mg/m~3,4-6周为45±1 mg/m~3。在试验的第14天、28天和42天,分别从每组随机取15只鸡处死,采集脾脏组织样品。分别检测:脾脏组织的显微结构和亚显微结构,氧化应激相关指标(T-AOC、GSH-Px、CAT和SOD活性,GSH、MDA和H_2O_2含量),能量代谢相关指标(Na~+-K~+ATPase、Ca~(2+)ATPase、Mg~(2+)ATPase和Ca~(2+)-Mg~(2+)ATPase活性),miRNA(miR-133a、miR-6615和miR-202-5p的水平)及其分别的靶基因(LOC101747543、SMAD7和PTEN的mRNA水平),Th1/Th2平衡相关细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ的mRNA水平),炎症相关因子(NO含量,iNOS活性,iNOS、HO-1、NLRP3炎症小体、NF-κB、TNF-α、COX-2和PTGEs的mRNA水平以及iNOS、HO-1和NF-κB的蛋白水平)、自噬相关因子(LC3-I、LC3-II、p62、PTEN、p53、PI3K、AKT、mTOR、Beclin1、Dynein、ATF3、ATG3、ATG5、ATG7、ATG10、ATG12、ATG14和ATG16L1的mRNA水平和LC3-I、LC3-II、PI3K、AKT和mTOR的蛋白水平)以及热休克蛋白(HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90的mRNA水平和HSP60、HSP70和HSP90的蛋白水平)。试验结果显示:(1)氨气中毒引起鸡脾脏组织显微结构和亚显微结构改变,引起了鸡脾脏组织炎症损伤和细胞自噬。(2)氨气中毒引起鸡脾脏组织T-AOC、GSH-Px、CAT和SOD活性以及GSH含量降低,MDA和H_2O_2含量升高,导致鸡脾脏组织发生氧化应激。(3)氨气中毒引起肉鸡脾脏组织Na~+-K~+ATPase、Ca~(2+)ATPase、Mg~(2+)ATPase和Ca~(2+)-Mg~(2+)ATPase活性降低,导致鸡脾脏组织发生能量代谢紊乱。(4)氨气中毒升高了鸡脾脏组织miR-133a、miR-6615和miR-202-5p水平,下调了它们分别的靶基因LOC101747543、SMAD7和PTEN的mRNA水平。(5)氨气中毒降低了鸡脾脏组织IL-2和IFN-γ的mRNA水平,提升了IL-1β、IL-4和IL-6的mRNA水平,致使肉鸡脾脏组织的Th1/Th2平衡被打破并漂移向Th2。(6)氨气中毒降低了鸡脾脏组织抗炎因子HO-1的mRNA和蛋白水平;增加NO含量,iNOS活性,iNOS、NLRP3炎症小体、NF-κB、TNF-α、COX-2和PTGEs的mRNA水平以及iNOS和NF-κB的蛋白水平,导致了鸡脾脏组织的炎症损伤。(7)氨气中毒降低了鸡脾脏组织PI3K、AKT和mTOR的mRNA和蛋白水平,导致了鸡脾脏中PI3K/AKT/mTOR信号通路被抑制。(8)氨气中毒增加鸡脾脏组织LC3-I、LC3-II、p53、Beclin1、ATG14、ATG16L1、ATG12、ATG10、ATG5、ATG3、ATG7和Dynein的mRNA水平,降低ATF3和p62的mRNA水平导致了鸡脾脏组织的细胞自噬。(9)氨气中毒增加鸡脾脏组织HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90的mRNA水平,以及HSP60、HSP70和HSP90的蛋白水平。机体动员了热休克蛋白来抵御氨气中毒。热休克蛋白的升高可能是一种代偿机制。结果表明,过量氨气对鸡脾脏具有免疫毒性,氨气中毒导致鸡脾脏氧化应激、能量代谢紊乱、Th1/Th2失衡、炎症损伤、细胞自噬和热休克蛋白增加。鸡脾脏在氨气中毒条件下,机体动员了热休克蛋白发生保护性反应,热休克蛋白的增加可能是一种抵抗氨气中毒的代偿机制。
【图文】：

鸡脾,苏木精-伊红染色,显微结构,对照组

C3））脾脏动脉壁平滑肌周围发生淀粉样变性（Al），红髓萎缩（RPS）（图3-1（C2））图3-1 鸡脾脏显微结构（苏木精-伊红染色，400倍），A：对照组，B：中氨组，C1-C3：高氨组Fig. 3-1 Microstructure of chicken spleens (hematoxylin-eosin staining, ×400), A: the controlgroup, B: the middle ammnia group

鸡脾,亚显微结构,对照组,氧化应激

线粒体数目以及线粒体的损伤程度增加，，自噬泡出现的数量显著增加氨气中毒诱导脾脏细胞的自噬具有剂量依赖效应图3-2 鸡脾脏的亚显微结构，A：对照组，B：中氨组，C1-C2：高氨组Fig. 3-2 Ultrastructure of chicken spleens, A: the control group, B: the middle ammnia group,C1-C2: the high ammnia group3.2 鸡脾脏中氧化应激和能量代谢相关因子的测定3.2.1 鸡脾脏中氧化应激相关因子的结果为了评价鸡脾脏组织中的氧化与抗氧化水平，我们检测了 T-AOC SOD CAT 和 GSH-Px的活性以及 GSH H2O2和 MDA 的含量（图 3-3）我们发现在第 14 天第 28 天和第 42
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X171.5;S858.31

【参考文献】