基于共轭芴和功能核酸的荧光探针构建及其在铅离子检测中的应用研究

发布时间：2020-04-17 06:19

【摘要】：铅离子具有毒性大、易生物富集、不可生物降解等特点,是一种广泛存在于环境中的重金属离子,也是常见的环境污染物。人体可以通过饮食摄入环境中的铅,富集至一定含量后易导致铅中毒,威胁生命健康。传统的仪器分析方法具有设备成本高、样品前处理复杂等缺点,因此构建操作简便、灵敏度高、成本低的Pb~(2+)检测分析方法具有重要意义。以功能核酸为识别单元的生物传感器由于高灵敏度和特异性在分析检测领域受到越来越多研究者的关注。荧光分析方法具有高灵敏度、重现性好等优点,广泛应用于环境监测、生物成像、分子诊断等领域。核酸荧光探针是以具有特异性结合靶标物质的功能核酸为识别单元、可发射荧光的荧光材料为信号单元构建的探针。本文利用共轭芴具有稳定的发光性能、高量子产率等优点,以可发射荧光的荧光材料共轭芴衍生物(CF)为信号单元,设计构建了单标记的荧光核酸探针CF-DNA,简化了核酸探针的设计合成步骤,避免了复杂标记对核酸识别性能的影响,实现了Pb~(2+)的高灵敏度和高选择性检测,体现出较显著的创新性,并取得了以下的研究成果:(1)以小分子芴为原料,先合成2,7-双(4-苯甲酸甲酯)-9,9-二己基芴(CF_1),经水解后得到2,7-双(4-苯甲酸)-9,9-二己基芴(CF_2),然后与N-羟基琥珀酰亚胺反应制得2,7-双(4-苯甲酸)-9,9-二己基芴活性酯(CF),FT-IR和~1H-NMR表明,其结构与预期设计相符。将2,7-双(4-苯甲酸)-9,9-二己基芴活性酯(CF)与氨基修饰的富G序列Pb~(2+)-DNA反应,经HPLC纯化分离后得到设计构建的CF-DNA探针。CF-DNA探针在260 nm和340 nm有明显的紫外吸收峰,分子量为5497.4,与理论设计值相符,荧光激发波长为340 nm,荧光发射波长为415 nm。(2)在CF-DNA核酸探针溶液中加入Pb~(2+)后,圆二色谱中260 nm处正峰和240nm处负峰的信号明显增强,溶液中胶粒的平均粒径由1254 nm减小到1003 nm,表明核酸分子从无序状态转变为平行型G-四链体结构,CF-DNA探针与Pb~(2+)有较好的特异性结合,Pb~(2+)的加入使CF-DNA探针在水溶液中聚集状态发生变化。CF-DNA探针检测Pb~(2+)的最优条件是:CF-DNA探针浓度为100 nM,选用PBS缓冲溶液作为检测的缓冲环境,CF-DNA探针与Pb~(2+)反应时间为15 min,反应温度为30℃。(3)CF-DNA探针对Pb~(2+)检测具有高灵敏度,检测限为0.36 nM,并对Pb~(2+)检测具有很好的选择性,而且CF-DNA探针具有较好的重复性和稳定性。采用加标回收法在对实际水样Pb~(2+)检测中,Pb~(2+)的回收率在96.6%-106%之间,显示出良好的检测效果,对在实际环境中Pb~(2+)的检测具有较好的应用前景。(4)利用自制的CF-DNA探针和氧化石墨烯(GO)对单链DNA的强吸附作用和高效的荧光猝灭性能,设计构建了CF-DNA/GO探针,其检测Pb~(2+)的最优条件是:CF-DNA探针浓度为150 nM,GO浓度为50?g/mL,CF-DNA/GO探针与Pb~(2+)反应时间为30 min,反应温度为30℃。(5)CF-DNA/GO探针对Pb~(2+)检测具有高灵敏度,检测限为0.24 nM,对Pb~(2+)检测具有很好的选择性,而且CF-DNA/GO探针具有较好的重复性和稳定性。采用加标回收法在对实际水样Pb~(2+)检测中,Pb~(2+)的回收率在98.3%-102%之间,显示出良好的检测效果,对在实际环境中Pb~(2+)的检测具有较好的应用前景。
【图文】：

荧光探针,检测原理,核酸

1-1 基于 FAM 标记荧光探针用于 AFB1 的检测原理图Schematic representation of FAM aptamer probe in detectFB1 时，FAM 荧光素标记的核酸适体与含猝灭基团 T形成互补双链 DNA，核酸适体的荧光被猝灭。当体系1 结合形成复合物，核酸适体与互补链结合力减弱，荧荧光信号恢复，，从而实现对 AFB1 的检测。于其独特的尺寸结构，因而具有如表面效应、量子尺寸的物理化学性质[63]。研究者们将核酸适体与纳米材料结标物的检测。Zhu 等[64]利用 GO 对单链 DNA 的吸附与O 荧光探针用于双酚 A（BisphenolA，BPA）的检测。发生了构象的转变，使含 FAM 荧光团的 DNA 从 GO FRET 效应减弱，荧光信号增强，该荧光探针对 BPA 的

原理图,端粒酶,金纳米粒子,功能化

分子信标构建的荧光探针是带负电荷的亲水性生物大分子，能够在细活细胞体系中检测靶标分子，实现在分子水平上对生物体内活性物质监测，为肿瘤诊断与生物医学提供了新的思路与平台。如图 1-2，Q结构设计了功能核酸探针用于原位成像以及细胞内端粒酶活性检测。由端粒酶引物（TSP）短序列与 3’端巯基标记构成茎部和较长序列子与分子信标通过 3’端巯基结合，因而 5’端的荧光 Cy5 荧光基团与RET 而致使荧光猝灭。在端粒酶的作用下，引发 MB 的 TSP 片段扩增，探针的发夹结构打开，荧光点亮。通过探针与活细胞孵育，可在细号检测。通过动态监测端粒酶活性对在不同剂量端粒酶药物作用下的检测细胞端粒酶含量，由此区分正常细胞与肿瘤细胞。Qian 等[71]还利子信标结合，在 miRNA 与 MB 特异性结合后打开信标，荧光信号增以实现对细胞内 miRNA 的高灵敏度检测与胞内原位成像，还可以在行光热治疗，破坏癌细胞，实现癌症靶向治疗。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X832;O657.3

【参考文献】