PM2.5对巨噬细胞RAW264.7的毒性作用及机制探讨

发布时间：2020-04-22 01:07

【摘要】：PM_(2.5)是指环境空气中空气动力学直径≤2.5μm的细颗粒物,可以较长时间在空气中悬浮,因其粒径小,比表面积大,活性较强,易附带有毒、有害物质,并且容易被吸入沉淀到肺泡当中,对肺部产生很大的影响,损害人类的健康。本实验采用体外暴露的实验方法探讨杭州城区大气PM_(2.5)对RAW264.7细胞的毒性作用及机制,主要结果如下:(1)经过索氏提取和GC-MS测定PM_(2.5)中有机物各组分的含量,利用质谱检测PM_(2.5)中金属元素的含量以确定颗粒物的主要成分,杭州城区大气中的PM_(2.5)的主要有机成分是正构烷烃、多环芳烃(PAHs)和磷酸二甲苯(PAEs),其中正构烷烃含量最多约占总体的40%。金属元素主要研究了Al,Cr,Mn,Fe,Ni,Cu,Zn,As,Cd,Pb,其中Zn的含量最多。从实验结果可以说明,正构烷烃和Zn是有机污染物和重金属污染物含量最多的种类,同时也可推测杭州PM_(2.5)的来源主要是化石燃料的燃烧和生物质的挥发。(2)将不同浓度的PM_(2.5)和RAW264.7细胞共培养24 h,使用倒置显微镜、荧光显微镜以及透射电镜下观察细胞表面、细胞器损伤以及ROS分布,可以发现暴露后的细胞形态发生明显变化,细胞破碎,细胞膜边缘不明显并且细胞器中有空泡产生。ROS分布随着暴露浓度的增高绿色荧光明显增多。由此可以得出结论PM_(2.5)可以使细胞形态发生变化,并影响细胞产生氧化损伤。(3)采用不同浓度的PM_(2.5)和RAW264.7细胞共培养24 h,使用MTT法检测细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率、周期的变化以及线粒体膜电位情况,然后测定细胞内NO漏出量和ELISA法检测免疫相关蛋白TNF-α、IL-1、IL-6的生成变化。MTT法测得细胞存活率显著下降,达到最大暴露浓度(800μg/mL)时,细胞活力仅为47%。流式细胞仪结果显示细胞凋亡增加,同样的达到暴露浓度(400μg/mL)时,细胞早期凋亡率为14.7%,晚期凋亡率为5.2%,但是细胞周期和线粒体膜电位未发生明显的变化,免疫相关因子TNF-α、IL-1、IL-6生成量增多,NO漏出量也增多,说明PM_(2.5)对细胞产生较大的毒性作用,并且通过对细胞产生氧化损伤和炎症损伤使细胞发生凋亡。(4)采用不同浓度的PM_(2.5)和RAW264.7细胞共培养24h,收集细胞,使用荧光定量PCR在分子水平上检测凋亡相关基因Bax,Bcl-2,P53和氧化应激相关基因Sod1,Sod2,Gpx1,Gpx2,INOs和Cat的表达情况,以确定细胞发生凋亡的途径和抗氧化失调途径。凋亡基因P53和Bax表达均上调,Bcl-2表达下调。氧化应激相关基因的表达也有相应的变化,表达均上调。说明PM_(2.5)对细胞的毒性损伤在分子水平上都有较显著的影响,抗氧化剂活性有所降低,并且作用在P53凋亡通路上使P53凋亡通路上基因也发生了显著地变化。(5)为了进一步寻找更多PM_(2.5)致细胞产生毒性的代谢途径,本文使用转录组学技术利用大数据平台富集细胞发生变化的代谢途径的通路,结果表明,20个差异基因表达上调,涉及了PI3K-Akt信号途径、NOD-like受体信号途径、Jak-STAT信号途径、TNF信号途径、谷胱甘肽代谢途径、DNA-sensing信号途径、矿物质吸收途径、血管收缩系统、一氧化氮代谢途径、NF-kappa B信号途径等多种代谢途径,说明细胞在多个代谢通路上影响了细胞生理活动,致细胞发生氧化应激、炎症反应和凋亡。综上所述,通过ROS生成增多,细胞活力减少、凋亡基因Bax,Bcl-2,P53和氧化应激基因Sod1,Sod2,Gpx1,Gpx2,INOs和Cat的表达变化和炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6的释放量增多,可以说明PM_(2.5)对细胞产生了较大的毒性作用,毒性机理涉及NOD-like受体信号途径和Jak-STAT信号途径等多个代谢通路。
【图文】：

样品,有机污染物,正构烷烃含量,甲酸酯

图 2-1 PM2.5 样品Fig.2-1 The sample of PM2.5 有机污染物含量测定结果2 可以看出，，PM2.5中的有机污染物有三大主要的类甲酸酯和正构烷烃。其中正构烷烃含量最高，正构烷物，其中 13c 的含量最高，约占 10%，如图 2-3 所示究中如图 2-4，发现 DEHP 的含量最高占 3.7%，跟生活关。多环芳烃中 BbF 和 Bghip 的含量也相对较高，约占

电镜图,电镜,存活率,毒性作用

图 3-2 不同浓度暴露下细胞电镜图Fig.3-2 Electron microscope of cell.3 MTT 结果为了明确 PM2.5 对巨噬细胞产生毒性作用，本实验用 MTT 法检测暴露胞存活率，由图 3-3 可以看出细胞在经受 PM2.5 暴露 24 小时后的存活率露浓度的增高而显著降低。并且在最高浓度时，细胞的存活率仅仅为 46%出半数致死量为 721.329 μg/mL，为后续实验浓度的筛选做准备。实验结果2.5 对巨噬细胞有很大的毒性作用，并呈现浓度-效应关系。
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R994.6;X513

【参考文献】