基于微生物组学的菲律宾蛤仔黏附污泥絮凝剂产生源研究

发布时间：2020-05-05 19:24

【摘要】：菲律宾蛤仔黏附污泥(Ruditapes philippinarum conglutination mud,RPM)是菲律宾蛤仔水产养殖的典型副产品废物,而舟山水产养殖场的RPM被新近报道为一种有前景的天然生物絮凝剂资源。旨在弄清楚RPM絮凝活性是否具有地域依赖性以及探索絮凝产生原因以拓宽其开发范围,本研究对RPM的絮凝剂产生源及其分离的絮凝活性菌株进行了系统性研究。来自大连、威海、舟山和湛江四个地点的RPM具有絮凝活性,其冷冻RPM样品絮凝率在8 g/L达到最高(61.9±2.4%至73.2±0.9%),新鲜RPM样品絮凝率最高达到91.34±1.18%,表明RPM的絮凝活性是广泛存在的。将不同地点的RPM样品进行粗多糖和多样性分析,结果表明地域差异性导致RPM细菌群落结构和多糖组成的差异,而细菌群落产生的多糖可能是RPM的絮凝活性基础。所有样品中的重叠OTUs占总序列44.6-62.22%,TOP 25属均为重叠OTUs,TOP 50里82%为重叠OTUs,这些OTUs可能是RPM里负责产生絮凝剂和承担絮凝活性的“核心基因组”。细菌的抑制生长显著降低RPM的脱色率,真菌的抑制无显著性变化,而胞外多糖可能是RPM絮凝活性主要承担者,表明RPM里细菌群落直接影响多糖组分和脱色率。黄杆菌科(Flavobacteriaceae)的成员可能是RPM絮凝活性的主要贡献者,如Lutibacter(3.99-16.13%),Maribacter(4.77-15.13%)。低丰度群落在决定RPM群落结构中可能起重要作用,高丰度群落反而辨识度不高,这些群落结构间的生态环境功能未来仍需进一步研究。从RPM中分离获得两株高絮凝活性菌株JP和GHS18,絮凝率分别为80.0%、75.1%。综合16S rDNA序列比对和生理生化结果,菌株JP和GHS18分别别被鉴定为Pseudoalteromonas undina和P.paragorgicola。对菌株JP和GHS18进行基因组框架扫描和基因预测,分别预测到3746、4342个基因,14个rRNA/87个tRNA、11个rRNA/94个tRNA。将预测的基因注释到数据库COG、GO、KEGG、NR和Swiss-Prot中,在两株菌株基因组中均发现了具有絮凝活性的胞外聚合物合成途径中前体底物基因(UDP-Glucose、GDP-mannose和UDP-glucuronate等)和重复寡糖单元基因(UDP-Gal、dNTP-D-Glu、dNTP-L-Rham和UDP-ManNAcA等),然而将重复寡糖单元聚合成多糖的eps基因簇并未发现,推测其具有类似的基因簇代替行使功能。本研究揭示了RPM共附生细菌承担了主要的絮凝活性,是RPM絮凝剂产生源,为未来开发RPM及其共附生絮凝活性菌株为发酵产品提供了一定的理论依据,以及对絮凝活性菌株的产絮凝剂生物合成途径更进一步的基因调控研究奠定了基础。
【图文】：

图 2-1 中国四大海域的代表性采样点地理位置Fig. 2-1 The R. philippinarum sampling locations along China coasts 样品絮凝率测定性测定方法在 Mu 等（2018）使用高岭土悬浮液法测定基础上进行60]。取 93 mL 4 g/L 高岭土悬浮液，5 mL 10 g/L 氯化钙溶液和 2 mL 泥样品依次添加于 250 mL 烧杯中。菲律宾蛤仔黏附污泥样品浓度8、10、15 g/L。所有溶液均用人工海水替代参照方法里的去离子水加 2.0 mol/L 盐酸溶液或 2.0 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 值至 7.5，拌混合液 1 min，然后以 80 rpm 缓慢搅拌混合液 2 min。静置 10 分便携式可见分光光度计在 550 nm 吸光度下进行光密度（OD）值测 2 mL 人工海水替代 2 mL 菲律宾蛤仔黏附污泥样品进行 OD 值测三次平行样测定。絮凝率（FR，Flocculation rate）计算公式为：FR (%)=A-BA×100B 为分别为对照组和 RPM 样品组在 550 nm 吸光度下的 OD 值。

中国四大海域采集的菲律宾蛤仔黏附污泥冷冻泥样絮凝率（A）和舟山采样点的黏附泥冷冻处理前后絮凝率（B）-2 The flocculation activity of freezing-treated RPM from four China coastal locations (A), afresh RPM and freezing-treated RPM from Zhoushan location (B)不同地点 RPM 样品粗多糖成分比较分析糖含量制的葡萄糖标准品溶液标准曲线如图 2-3 所示，表明在一定的葡萄糖溶液浓，本实验所用的葡萄糖标准品的 OD 值与其浓度成线性关系，R2= 0.998，，，因此可用于测定待测样品的总糖含量。y = 0.5909x + 0.0224R2= 0.9980.20.30.40.50.60.7光密度值（OD490nm)
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X714

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本文编号：2650636