双酚A及其替代物的内分泌干扰与代谢扰动效应研究

发布时间：2020-05-12 19:49

【摘要】：目前,大量国内外研究表明人类正频繁受到内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)的暴露威胁。因此,双酚A(Bisphenol A,BPA)等毒性效应明确、严重威胁人类健康的EDCs在世界范围内受到了管控或禁用。随着BPA的禁用,诸如双酚AF(Bisphenol AF,BPAF)、双酚F(Bisphenol F,BPF)和双酚S(Bisphenol S,BPS)等双酚类似物大量涌入市场。然而,越来越多的研究表明,这些与BPA结构相似的替代物也同样具有内分泌干扰效应。因此,为了更加高效地进行EDCs的筛选,以寻找更安全可靠的替代物,必须开发和建立更全面、更深入的毒性评价方法。本论文以BPA及其典型替代物BPAF、BPF和BPS为研究对象,一方面,以H295R细胞为体外模型,采用UPLC-MS/MS技术评价了双酚A及其典型替代物对激素合成与分泌水平的干扰效应,建立了同时测定多种激素的检测方法,为寻找更安全的双酚A替代物提供了技术支持;另一方面,以代谢敏感的HepG2细胞为体外模型,结合~1H-NMR和PCR Array两种高通量技术探究了双酚A及其替代物的代谢扰动效应和可能的代谢调控机制,弥补了BPA及其替代物在代谢组学研究上的空白,利用细胞实验与非靶标的代谢组学技术进行毒性靶点的初筛也为化合物及其替代物的毒性评价提供了一种全新的研究思路和方法。主要研究内容及结果包括以下两个部分:(1)采用UPLC-MS/MS技术建立了同时测定9种类固醇激素的方法,并以H295R细胞为模型,研究BPA、BPAF、BPF和BPS暴露对胞外激素分泌水平的影响,以评价BPA及其替代物的内分泌干扰效应。结果表明:所建立的UPLC-MS/MS同时测定9种类固醇激素方法的专属性、精确度和准确度良好,各目标激素在线性范围内均线性良好(r~20.99),且检测限和定量限均?1 ng/mL(孕酮、雄烯二酮和睾酮的定量限?0.05 ng/mL),基质效应在83.87~119.46%之间,回收率均在80.03~113.32%范围内。此外,对H295R细胞胞外类固醇激素水平的测定结果显示,BPA与BPF对孕酮、17α-羟基孕酮、雄烯二酮、睾酮和17β-雌二醇的干扰能力均相近,且对孕酮、17α-羟基孕酮和17β-雌二醇的干扰能力强于BPAF和BPS。此外,4种BPs在10~-66 M浓度下均能显著下调雄烯二酮和睾酮水平并显著上调17β-雌二醇水平,即均有雌激素激动作用和雄激素抑制作用。通过比较各激素水平发生显著变化的浓度,发现BPA及其三种典型替代物的激素干扰能力由强到弱为:BPA、BPFBPSBPAF。(2)采用~1H-NMR和PCR Array技术研究BPA、BPAF、BPF和BPS暴露对HepG2细胞胞外代谢产物和胞内相关代谢基因表达水平的影响,从基因和代谢层面系统探究BPA及其替代物对人体健康的可能风险和毒作用分子机制。结果表明:BPA及其替代物能对7~15种代谢产物产生干扰,包括丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸等氨基酸,乙酸、乳酸、丙酮酸等糖酵解和三羧酸循环的中间体或终产物。此外,这些差异性代谢产物与3~8条代谢通路的扰动相关,其中包括丙酮酸代谢和丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢等常见的代谢通路。通过比较差异性代谢产物和受扰动代谢通路的数量,发现BPA及其三种典型替代物的代谢扰动能力由强到弱为:BPFBPABPAFBPS。通过糖代谢PCR Array分析发现,BPAF能通过上调丙酮酸激酶相关基因(PKLR)的表达水平以干扰糖代谢过程,而BPA、BPF和BPS能通过下调葡萄糖激酶相关基因(GCK)的表达水平以抑制葡萄糖感应功能发挥作用。综上,结合代谢组学和PCR Array技术探究潜在的代谢调控机制,并为未来的靶向风险评估确定潜在目标是有潜力的。
【图文】：

浙江工业大学硕士学位论文结果 A 及其替代物对 H295R 细胞活性的影响采用 MTS 法研究了 BPA、BPAF、BPF 和 BPS 对 H295R 细胞活固醇激素分泌水平测定实验中的药物浓度选择（图 3-1）。与溶10-5M 浓度下，，BPA 及其 3 种典型替代物 BPAF、BPF 和 BPS 均出显著的细胞毒性（p＜0.05）；在10-9M~10-6M浓度下，各处理组显著的细胞毒性（p＞0.05）。为排除细胞死亡对实验的影响，细胞毒性浓度（10-9、10-8、10-7和 10-6M）进行后续实验。

27图 3-2 质控样品中各目标化合物的 MRM 色谱图Figure 3-2. MRM chromatogram of target compounds in QC samples.
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X703

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