基于微流控技术的发光细菌水质毒性检测装置研究

发布时间：2020-05-16 03:01

【摘要】：我国工业实力快速发展的同时也带来一系列的环境问题。工业生产过程中产生的一系列污染物质随着废气、废水和废渣等进入到周围的环境中,对人们的健康安全构成了潜在威胁。利用发光细菌法进行水质急性毒性检测,可以直观全面的反应污染物对人体的毒性作用。发光细菌法不仅简便快速,而且操作简单,容易和多种光学元件耦合,还具有良好的重现性。但是现有设备操作复杂,检测耗时长,并且不适用于在线连续监测。此外复苏后的发光细菌发光强度不稳定,使检测结果存在较大误差。本课题旨在以青海弧菌Q67作为受试对象,建立一套基于微流控技术的新型水质急性毒性分析检测装置,推动发光细菌水质急性毒性检测方法向在线连续检测方向的发展。本文首先建立了以2ml离心管作为样品池的水质急性毒性检测装置,以此装置作为对比检测系统。通过完善样品室设计、光检测系统和采样系统使装置能够稳定高效运行。用该装置对不同OD600值的菌液发光强度进行测定,从而确定其对光信号的分辨能力,并通过3次重复实验获得检测结果的相对标准偏差为2.1%。此外,还确定了青海弧菌最佳发光的基本检测条件,即以生理盐水作为悬浮液,调节待测水样p H为7.0~9.0,菌液用量控制在200μl。利用该装置检测不同浓度的Zn2+和Cd2+对青海弧菌Q67的水质急性毒性,获得了Zn2+和Cd2+的半致死浓度EC50值。论文重点设计制作了一种毒性分析微流控芯片,优化了微混合器,提高了混合性能。芯片两入口角度为90°,通道宽度为100μm,芯片厚度为100μm。芯片通过COMSOL软件模拟两流体组分在通道X-Y截面上的浓度部分情况确定了混合性能较优的微混合器结构。比较了不同长度直通道和两种不同结构弯道的混合性能差异,选择了圆角弯道作为芯片的混合结构,并确定了混合结构的单元数。两流体组分充分混合后进入芯片检测区域,检测区域为六边形结构,长约10mm,宽约10mm,检测结束后通入生理盐水冲洗检测芯片。最终建立了基于微流控芯片的新型水质急性毒性分析检测装置。测试了几种典型污染物对青海弧菌的急性毒性。验证了该新型装置对于不同OD600值的菌液发光强度的分辨能力及其三次检测结果的重现性(相对标准偏差为0.7%)。随后,建立了该新型装置对5种重金属、3种抗生素和3种染料的水质急性毒性检测方法,获得了这11种污染物对青海弧菌Q67的剂量效应曲线,得出了各个污染物分别在5min、10min和15min时的EC50。掌握了这几种污染物的毒性强弱规律如下:Cu2+Pb2+Cd2+Zn2+Ni2+,环丙沙星诺氟沙星青霉素G,罗丹明B橙黄G亚甲基蓝。明确了重金属、抗生素和染料这三类物质对青海弧菌产生毒性的不同机理,重金属主要是通过抑制荧光素酶的合成来抑制青海弧菌的发光反应,抗生素主要是通过破坏细胞结构导致细菌死亡或抑制细菌活性来抑制青海弧菌的发光反应,而染料分子的毒性作用方式主要与染料类型、分子大小和官能团性质有关。该装置的检测结果在时间上的稳定性较好,且检测结果的相对标准偏差较低。
【图文】：

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其中常用的细菌状态主要有两种：一种是使细菌悬浮于微型生物反应器中的液态相中，另一种是将细菌固定在一次性样品池中。图1-1 三种用于水质毒性检测的新型生物传感器：（A）细菌悬浮型生物传感器[16];（B）冻干细菌型生物传感器[17]；C）细菌固定型生物传感器[18]，（1）细菌固定在一次性样品池中，（2）细菌固定在光纤上，（3）细菌固定在生物芯片中。

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对它们的性能进行了比较[18]。两套系统均封闭在一个暗箱中，利用 CCD 相机中对细菌发出的光信号进行图像捕捉并记录。这两套系统的区别之处在于细胞的保存方式不同（如图 1-2 A），Lumisens Ⅲ系统中的细菌悬浮液 4%的琼脂糖溶液混匀后固定在微井中，保持着较高的生物活性；而 Lumisens Ⅳ系统中使用的细菌在 96 孔微板中经过了冷冻干燥过程，活性相对较低。作者用这两套系统在 10 天时间里连续检测了蒸馏水或环境样品中的汞（Hg），每天将细菌暴露于含有 500 nM Hg 的样品中 100 min，剩下的时间持续通入细菌培养液。结果表明，，Lumisens Ⅲ系统自启动 6 h 后产生响应信号（如图 1-2 B），并且在测试的 10 天时间里，生物发光水平是不稳定的，变化率达 40%，固定化细菌在第 3~6 天处于稳定的生长阶段，生物发光信号的重现性和重复性接近 5%，；Lumisens Ⅳ系统能够在 10 天时间里对蒸馏水样品或污水厂样品中的汞（Hg）进行稳定检测，启动 1.5 h 后便可获得响应信号，生物发光信号的重现性达 3%。在 Lumisens Ⅲ系统中，细菌在测试过程中会受到之前暴露的污染物的影响，导致后续实验中的细菌活性降低，从而影响实验结果的一致性。而在 LumisensⅣ系统中，细菌被限定在微孔板中的各个微孔中，执行独立地单次分析，但是操作相对较为繁琐，重复性也有所降低。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X832

【参考文献】