菲律宾蛤仔黏附污泥中絮凝活性胞外多糖的提纯及结构表征

发布时间：2020-06-03 11:21

【摘要】：微生物絮凝剂是由细菌等微生物经过发酵提取所得到的的生物大分子,具有较好的絮凝效果,其成分主要包括多糖、蛋白质、核酸、纤维素等。菲律宾蛤仔粘附污泥(RPM)最近被报道为一种天然的高效生物絮凝剂,推测黏附污泥中的微生物是絮凝现象产生的原因。本文深入研究了三株絮凝活性菌株的胞外多糖聚合物,由于其良好的絮凝效果,采用多种手段对其结构进行了表征,并探讨其结构信息可能对絮凝效果产生的促进作用,因此,本文从筛选的菌株中做了以下工作:(1)微生物胞外多糖的提取纯化选取菌株,本文从实验室中初期筛选鉴定的絮凝活性菌株中选取三株Halomonas sp.GHF11、Pseudoalteromonas sp.GHS19和Pseudoalteromonas sp.JP,通过接种培养,用乙醇沉淀法获得多糖粗品。多糖粗品经过Sevag法脱蛋白处理后,经过阴离子交换柱DEAE和Sephadex凝胶渗透色谱柱进一步纯化得到多糖纯品。对获得的多糖纯品进行絮凝活性测试和结构信息的表征。(2)多糖纯品的活性测试对微生物多糖纯品的活性进行了探究,分析了不同浓度下多糖的絮凝活性和脱色活性的变化规律,找到了最佳活性的多糖浓度。结果表明在0.5 mg/L的F11多糖剂量时,最佳絮凝效果达到71.2%,而在反应剂量小于0.1 mg/L或大于1.0 mg/L时,絮凝效果较差。另外,对F11多糖纯品关于三种染色剂包括甲基蓝、结晶紫、孔雀石绿的脱色效果进行了探究。结果显示,该多糖对于孔雀石绿的脱色效果最好,在反应剂量1.8 mg/L时,达到最佳脱色效果92.4%。同样地,反应剂量过高或较少,脱色效果将逐渐减弱。同样地,S19多糖的絮凝活性与其剂量有着相似的关系。在剂量为0.9 mg/L时,达到最佳絮凝率为78.8%,反应剂量为2.0 mg/L时,有最佳脱色活性87.9%。JP多糖在投加剂量为0.8 mg/L时,达到最佳絮凝率为83.5%,反应剂量为1.5 mg/L时,有最佳脱色活性93.6%。(3)多糖结构的解析分离纯化的多糖经过一系列手段进行结构的表征。红外光谱显示该多糖的主要官能团,包括羟基、羰基、亚甲基、碳骨架环等。凝胶渗透色谱法测得F11和S19两多糖分子量分别为31KDa和1010KDa,使用高效液相色谱测得F11样品单糖组成为甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖、核糖。利用气相质谱联用仪对多糖进行甲基化分析,总离子流图和质谱图显示,其糖苷键的连接方式有葡萄糖末端连接、葡萄糖1→2→3→4连接,甘露糖1→2→3→4→6连接。S19样品单糖组成为葡萄糖和甘露糖,甲基化分析显示,其糖苷键连接方式为葡萄糖Glc1→3连接、葡萄糖Glc1→4连接、葡萄糖Glc1→3→4连接以及甘露糖Man1→2→3→4→6连接。
【图文】：

标准曲线,葡萄糖,标准曲线,苯酚

动部分收集器连续收集洗脱液。然后用硫酸苯酚法测定各管的糖含量，收集同一吸收峰下的洗脱液，浓缩后冷冻干燥，从而获得所需的纯多糖产品。总糖含量的测定多糖含量的测定便于分析多糖中含有其他杂质含量的高低，只有杂质含量较下一步的操作。本文使用苯酚硫酸法[67]来测定总糖含量。试剂的配制：80 %的苯酚：将 80 g 苯酚溶于 20 g 去离子水中，，得到 80%的苯存在棕色瓶中冷藏待用。6 %的苯酚：测定标线时使用 80 %的苯酚进行稀释作葡萄糖标准曲线：在 105 ℃的烘箱中将葡萄糖烘干至恒重，准确称取葡于 500 mL 容量瓶中，定容后得 40 μg/mL 的葡萄糖标准溶液，然后分别吸取0.5、1.0、1.5、2.0 mL，用去离子水补充至 2.0 mL，然后加入 1.0 mL 6%苯酚和硫酸，摇匀，沸水浴 15 min，冷却后，测量 490 nm 处的吸光度。横坐标为多g/mL），纵坐标为吸光度（OD），制作多糖含量的标准线性方程如图 2-1 所示

曲线,紫外扫描,粗多糖,蛋白

剂量对絮凝活性和脱色活性的影响剂量的多糖溶液，溶解于去离子水中，分别测定其絮凝活性，用水重复三次，找出最佳絮凝活性和脱色活性对应的多糖浓度，并分析度时絮凝活性的变化规律。讨论纯度分析酸苯酚法测定多糖总含量, 与多糖粉末实际重量对比,经称量, F11 57 mg，硫酸苯酚法测得含糖量为 49.6 mg，占总重量的 87 %，纯。另外对多糖溶液进行紫外扫描，观察是否有蛋白质、核酸的特征扫描曲线较为平滑，不含有 220 nm 和 280 nm 的紫外吸收，证明多干净，且不存在核酸的影响，因此认为该多糖粉末纯度很高，可进研究和活性的测定。
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X703;X172

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