转基因油菜毛状根对重金属镉胁迫响应及其转录组学研究
发布时间：2020-06-14 11:01
【摘要】：目的:生态环境部和国土资源部调查发现,镉污染是目前中国污染最严重也是污染面积最大的重金属污染。植物既是重金属流入人体最主要的途径之一,也是开展重金属污染土壤植物修复工程最关键的载体。油菜(Brassica campestris L.)是典型的镉超富集植物之一,具有生长周期短、生物量大、适应性强的优点。根是植物接触重金属污染物的主要器官,也是第一个开始应激反应的位点。转基因毛状根在生理上十分接近真正的根,并且具有生长迅速、生物量大、培养不受季节限制、可以排除根际微生物影响等优点。因此本论文以转基因油菜毛状根为实验材料,对其在不同镉浓度和时间胁迫下的生理响应特性、镉及必需元素的富集能力进行研究,通过生物信息学策略综合分析转基因油菜毛状根响应镉胁迫的转录组测序数据,挖掘转基因油菜毛状根响应镉胁迫的关键基因和代谢通路,为后续的油菜毛状根转基因改造以及构建实用型镉超富集油菜提供理论依据。方法:本论文以A4农杆菌诱导的转基因油菜毛状根为实验材料,利用MS培养基悬浮培养的方法建立稳定的转基因油菜毛状根体系。对转基因油菜毛状根在不同镉浓度(0,25,50,100,200,400 μmol/L)和时间(1d和7 d)胁迫下的生理响应进行检测,检测指标包括生长状况、生物量、活性氧(reactive oxygen species,ROS)积累、抗氧化酶活力的变化、细胞凋亡以及镉与其他必需元素的含量;并且经统计学分析确定转录组测序的最适镉处理浓度和时间。利用二代测序技术将转基因油菜毛状根在镉胁迫前后的转录组进行了检测,综合利用生物信息学方法分析镉胁迫前后的转录组差异,筛选出差异表达的基因,进行Gene Ontoloty(GO)功能和KEGG Pathway富集分析,对部分基因进行RNA水平的Real Time PCR验证,对关键通路中的基因进行蛋白质水平的验证。结果:转基因油菜毛状根在30 d的生长周期里,依次经历了前10 d的对数生长期、中间10 d的稳定期和后10 d的衰老期。镉胁迫实验的结果表明,低镉浓度(100μmol/L以下)对毛状根的生长无显著影响,高镉浓度(100μmol/L以上)下毛状根的生长则受到明显的抑制,镉浓度为25 μmol/L镉胁迫7 d时,毛状根的鲜重最大(4.34 g)。转基因油菜毛状根中ROS的含量随着镉浓度的增加而上升,根中主要抗氧化酶(superoxide dismutase,SOD;peroxidase,POD;catalase,CAT)的活力在镉胁迫1d时,表现出先降低后升高的趋势;在镉胁迫7d时,表现出先升高后降低的趋势。碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色与丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量分析表明,根细胞的损伤随着镉浓度的增加越发严重。转基因油菜毛状根中的镉含量随着培养基中镉浓度的增加而增加,400μmol/L、7 d时,达到最大值2.97 mg/g。毛状根中的铁含量在镉胁迫1 d时随着镉浓度的增加显著上升,最大值达到14.52 mg/g;镉胁迫7 d时没有明显变化。镉胁迫7 d时毛状根中的钾含量是镉胁迫1d时(15.73 mg/g)的1.6倍。研究结果表明转基因油菜毛状根对镉胁迫的生理响应变化与镉的作用浓度和时间相关;同时镉胁迫造成了毛状根中铁、钾元素代谢紊乱,但转基因油菜毛状根对镉有较好的富集效果。统计学分析结果表明浓度为200 μmol/L的镉胁迫1 d时转基因油菜毛状根与对照组的差异较显著,适合进行转录组学测序(p0.05)。RNA质检显示,RNA质量良好,总量满足2次或者2次以上的建库需要,满足转录组测序建库要求。平均每个样品的比对率达到64.97%,样品间的均匀比对率表明样品之间的数据具有可比性。相关性和聚类分析结果显示,处理组与对照组的组内相关系数达到96%以上。DEseq2统计结果发现有1564个基因上调,830个基因下调。通过GO功能分类及富集分析和KEGG生物通路分类及富集分析,找出了 8个显著富集在细胞刺激的响应的GO terms和6个显著富集的Pathways。根据GO信息、Pathway信息相关性和FC值大小,选择其中8个显著差异表达基因(103845713、103874543、103835040、103872346、103875293、103867458、103855019、103870505)进行RealTimePCR验证,结果显示这8个基因的转录水平与转录组测序的结果一致。Western Blotting实验结果显示,镉胁迫造成了转基因油菜毛状根中谷胱甘肽合成酶和谷胱甘肽-S-转移酶的大量表达。结论:转基因油菜毛状根可以替代完整植株的根系进行重金属镉胁迫的研究,转录组测序和Western Blotting实验结果提示谷胱甘肽合成酶和谷胱甘肽-S-转移酶在转基因油菜毛状根响应镉胁迫的过程中发生了重要的作用。
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X171.5;S565.4
【图文】：
逦Ｈｉ逡逑需元素的转运蛋白或通道，这些转运蛋白或离子通道对于阳离子没有选择性或者逡逑特异性较低［１７］。镉离子的吸收与转运主要涉及以下相关蛋白（图１－１），主要包括逡逑ＮＲＡＭＰ家族、Ｐ－ｔｙｐｅＡＴＰａｓｅ、ＡＢＣ转运蛋白、ＣＡＸ家族、ＺＩＰ家族、ＬＣＴ转运逡逑蛋白、ＣＥ家族、ＹＳＬ家族［１８＿１９］。逡逑▲逡逑＾邋Ｖａｃｕｏｌｅ逦Ｖａｃｕｏｌｅ逦ＭＴＰ１逡逑Ｃｄ、秦邋Ｃｄ２＋逡逑＞逦（邋ｆｉ２＊逦ＰＣ－ＣＭ逡逑Ｎｒａｍｐ３邋｜Ｎｒａｍｐ４逦S缅澹龋停铃澹冲危粒拢茫垮危桑喝厘义希校茫茫溴澹垮澹危郑洌椋睿穑靛澹垮瘟隋危校茫茫溴义希煎澹矗绣澹校茫茫椋戾味危茫溴危徨义希慑危裕校缅澹螅睿簦瑁幔螅邋义希茫洌蓿欤洌幔欤澹垮
本文编号：2712684
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X171.5;S565.4
【图文】：
逦Ｈｉ逡逑需元素的转运蛋白或通道，这些转运蛋白或离子通道对于阳离子没有选择性或者逡逑特异性较低［１７］。镉离子的吸收与转运主要涉及以下相关蛋白（图１－１），主要包括逡逑ＮＲＡＭＰ家族、Ｐ－ｔｙｐｅＡＴＰａｓｅ、ＡＢＣ转运蛋白、ＣＡＸ家族、ＺＩＰ家族、ＬＣＴ转运逡逑蛋白、ＣＥ家族、ＹＳＬ家族［１８＿１９］。逡逑▲逡逑＾邋Ｖａｃｕｏｌｅ逦Ｖａｃｕｏｌｅ逦ＭＴＰ１逡逑Ｃｄ、秦邋Ｃｄ２＋逡逑＞逦（邋ｆｉ２＊逦ＰＣ－ＣＭ逡逑Ｎｒａｍｐ３邋｜Ｎｒａｍｐ４逦S缅澹龋停铃澹冲危粒拢茫垮危桑喝厘义希校茫茫溴澹垮澹危郑洌椋睿穑靛澹垮瘟隋危校茫茫溴义希煎澹矗绣澹校茫茫椋戾味危茫溴危徨义希慑危裕校缅澹螅睿簦瑁幔螅邋义希茫洌蓿欤洌幔欤澹垮
本文编号：2712684
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