百草枯对CIK细胞的毒性及其作用机制的初步研究

发布时间：2020-06-17 20:56

【摘要】：百草枯(paraquat,PQ)是一种水溶性联吡啶有机杂环类化合物,其销售和使用遍及全球,尤其是在发展中国家一直得到推广。PQ具有极高的水溶性和低挥发性,在农业生产中使用后,难免会通过地表径流和地下排水等方式进入水生态系统,造成自然水体或饮用水源污染,对动物和人类的生命安全与健康造成危害。PQ以其毒性大、中毒后死亡率高的特点引起各国研究者广泛关注。关于PQ的毒性机制目前已有较多研究,但PQ对水生生物毒性作用,尤其是对鱼类细胞的毒性作用及其机制目前知之甚少。本研究以草鱼肾细胞(CIK细胞)为实验材料,首先通过MTT法检测PQ对CIK细胞活力的影响,建立CIK细胞对PQ毒性作用的实验模型;然后检测PQ暴露对CIK细胞形态、细胞核形态的影响,并通过流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况;同时采用ELISA和qPCR方法检测CIK细胞抗氧化酶活性、炎性反应相关生化指标、细胞周期及凋亡相关酶和基因的表达变化情况,以期阐释PQ致鱼类细胞毒性作用的生化和分子机制。本研究的主要结果如下:(1)细胞活力实验检测结果显示,PQ对CIK细胞24 h、48 h和72 h的IC_(50)分别为252.65μM、9.84μM和2.63μM;细胞形态观察发现,PQ暴露明显改变细胞形态、引起细胞损伤,说明PQ暴露对CIK细胞具有毒性作用。(2)细胞周期检测结果发现,1-50μM PQ暴露可造成CIK细胞周期G_0/G_1期阻滞;qPCR检测结果发现,p53、p21、mdm2、gadd45、e2f4、cyclin b、cyclin e和CDK4细胞周期相关因子表达发生显著改变,提示这些细胞周期相关因子可能参与PQ导致的CIK细胞周期阻滞。(3)抗氧化酶活性检测结果发现,PQ暴露导致CIK细胞SOD和CAT活性明显降低,T-AOC含量明显下降,提示PQ可能扰乱CIK细胞抗氧化系统平衡;然而,PQ暴露却显著上调CIK细胞MDA水平,表明PQ暴露可能导致CIK细胞脂质过氧化。以上结果说明,PQ暴露可能造成CIK细胞氧化损伤。(4)ELISA检测结果发现,PQ暴露诱导CIK细胞促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β含量显著升高,改变IFN-γ含量;然而,CIK细胞抗炎性细胞因子TGF-β和IL-10含量却在低浓度PQ暴露早期明显升高、后期显著下降。以上结果说明,促炎性细胞因子的高表达和抗炎性细胞因子的低表达可能促进细胞炎性反应,提示PQ暴露可造成CIK细胞发生炎性反应。(5)Hoechst 33342染色观察结果显示,5μM、15μM、30μM和50μM PQ暴露显著诱导CIK细胞核固缩、形成凋亡小体;流式细胞仪检测细胞凋亡情况发现,PQ暴露可导致CIK细胞凋亡,且呈一定的剂量-效应关系;通过qPCR检测凋亡相关基因bax和bcl-2 mRNA的表达情况发现,PQ暴露显著诱导bax表达,然而bcl-2 mRNA表达水平却显著下调。进一步研究发现,PQ暴露能显著上调CIK细胞caspase-3和caspase-9的基因表达水平和酶活性。以上结果表明PQ暴露可能通过线粒体途径诱导CIK细胞凋亡。本研究结果表明,PQ暴露导致CIK细胞周期阻滞,并造成CIK细胞氧化损伤和炎性反应而引起细胞凋亡。本研究首次证实了PQ对鱼类细胞的毒性作用,并进一步丰富和完善PQ细胞毒性作用机制,为PQ安全使用以及水生态系统的保护提供理论支持。
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X592;X171.5
【图文】：

化学结构式

溶性联吡啶有机杂环类除草剂[1-2]。PQ 化学结构式如图，分子量为 257.2，物理状态下为无色或淡黄色，提纯品溶于水，几乎不溶于乙醇等有机溶剂，不溶于烃类，能腐定存在，经紫外照射后易分解。PQ 于 1882 年首次研制，在 1962 年投入市场销售。因其成本低廉、快速吸收、速良好的特性，在世界范围内已有超过 120 个发达或发展中展中国家迅速商业化，并在工商业、农业和园林等领域

活力,细胞相对活力,半数抑制浓度,效应关系

T 法检测 PQ 对 CIK 细胞活力的影响，结果如图 3-1 所示。采用 5-5细胞 24 h、48 h 和 72 h 均能显著抑制细胞活力，细胞相对活力随暴浓度的增大而降低，呈现出一定的时间-剂量-效应关系。通过对数对 CIK 细胞 24 h、48 h 和 72 h 的半数抑制浓度（IC50）分别为 252..63 μM。

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