PM2.5暴露对鸡胚心脏和肝脏发育毒性的评价

发布时间：2020-07-04 20:47

【摘要】：目的:采用鸡胚染毒实验模型探讨孵育鸡胚暴露于不同剂量的PM2.5后对鸡胚心脏和肝脏发育的毒性作用及其分子机制,为PM2.5暴露对子代心脏和肝脏发育的毒性机制提供一定的理论依据。方法:210只受精鸡蛋,其中第一批120只鸡蛋根据鸡蛋重量随机分为6组,PM2.5剂量分别为0、0.05、0.2、0.5、2和5mg/kg。根据第一批鸡胚实验结果,对第二批鸡胚实验的分组(90只鸡蛋)进行了调整,除去PM2.5为0.05mg/kg和5mg/kg剂量组,共分为4组,PM2.5剂量分别为0、0.2、0.5、2mg/kg。对鸡蛋表面进行消毒和气室注射染毒,随后放入孵箱中进行孵化,两批鸡胚的孵化条件完全相同。在鸡胚孵育4天和15天时,分别对各PM2.5剂量组的鸡胚进行采样,观察鸡胚心脏的发育情况并测量4天鸡胚心脏面积和15天鸡胚心脏横切面积。在鸡胚孵化后,对孵化幼鸡的心率进行测量,并对孵化幼鸡的肝功能血清学指标进行测量。采用HE染色观察孵化幼鸡心脏和肝脏的病理,并测量右心壁厚度。采用免疫组化检测孵化幼鸡心脏和肝脏组织NF-kB p65蛋白的表达,采用Western blot检测孵化幼鸡心脏和肝脏组织iNOS和MMP9蛋白的表达。结果:(1)孵育鸡胚暴露于PM2.5后,可导致孵育4天鸡胚的心脏面积和15天鸡胚的心脏横切面积明显增大,与对照组相比差异有统计学意义(P0.05)。(2)与对照组孵育鸡胚生存率相比,5mg/kg PM2.5组鸡胚的生存率明显降低,且差异有统计学意义(P0.05)。(3)孵化幼鸡的心率测量结果表明,与对照组相比,孵育鸡胚暴露于PM2.5后可导致孵化幼鸡心率明显加快,且差异有统计学意义(P0.05)。(4)孵化幼鸡心脏的HE染色结果显示,与对照组相比,孵育鸡胚暴露于PM2.5后可导致孵化幼鸡的右心壁厚度明显增加,且差异有统计学意义(P0.05);孵化幼鸡肝脏的HE染色结果显示,孵育鸡胚暴露于PM2.5后可导致孵化幼鸡发生肝脏脂肪变和肝脏炎性细胞浸润增加。(5)肝功能检测结果表明,与对照组相比,0.5mg/kg和2mg/kg PM2.5组孵化幼鸡血清中的谷丙转氨酶(Cereal third transaminase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)水平明显增加,且差异有统计学意义(P0.05)。(6)各PM2.5剂量组孵化幼鸡的心脏和肝脏免疫组化结果显示,与对照组相比,0.5mg/kg和2mg/kg PM2.5组孵化幼鸡心脏和肝脏组织中的NF-Kb p65蛋白的表达发生了明显上调,且差异有统计学意义(P0.05)。(7)孵化幼鸡心脏和肝脏Western blot检测结果显示,与对照组相比,在0.2mg/kg和0.5mg/kg PM2.5剂量组孵化幼鸡心脏中的iNOS和MMP9蛋白表达均明显上调,且差异有统计学意义(P0.05),但在2mg/kg剂量下,心脏组织中的iNOS和MMP9蛋白表达水平未升高,整体呈倒U型量效曲线;在肝脏组织中,与对照组相比,iNOS和MMP9蛋白表达均明显上调,且差异有统计学意义(P0.05)。结论:PM2.5暴露对发育鸡胚的心脏具有损伤作用,可导致发育鸡胚的心脏横切面积增大、幼鸡右心壁增厚和心率升高,并可引发肝脏脂肪变及炎症样损伤,提示发育鸡胚暴露于PM2.5后对孵化幼鸡心脏和肝脏的发育具有潜在的风险。此外,PM2.5暴露可诱导孵化幼鸡心脏和肝脏组织中的NF-kB p65、iNOS以及MMP9的表达水平显著升高,提示炎症反应可能为PM2.5暴露导致发育鸡胚心脏和肝脏组织损伤的作用机制之一。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114;X513
【图文】：

标准曲线,标准曲线,工作液,标准品

（3）将孵化 1 天的幼鸡心脏和肝脏组织剪碎并研磨后加入 100μL 裂解液，充浆。（4）在冰上放置 30min，使其充分裂解，每 10min 充分振荡一次，随后放入离心机 4℃离心（14000g, 5 min），取上清液，储存在-20℃冰箱备用。1.2 蛋白浓度测定孔酶标仪法（1）配制工作液: 根据标准品和样品数量，按 50 体积 BCA 试剂加 1 体积 C（50:1）配制成 BCA 工作液，充分混匀（混合时可能会有浑浊，但混匀后就会）。（2）稀释标准品：将标准品按 0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20μL 加到 96 孔板的蛋白品孔中，加 PBS 补足到 20μL。（3）将样品以 1:5 倍稀释，加 20μL 稀释液到 96 孔板的样品孔中。（4）每孔加入 200μL BCA 工作液，37℃放置 15-30min。用酶标仪测定 A562据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测。（图 1 和图 2 分别为本实验 BCA 法得到的心脏和肝脏组织的蛋白浓度标准曲线

标准曲线,标准曲线,分离胶,滤纸

图 2 肝脏组织蛋白浓度标准曲线1.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）选择洁净的玻璃板夹槽，在其中加入 10%分离胶置灌胶板，用双蒸水封胶，，避免产生气泡。静置，待 30min 分离胶凝固后再加入 5%浓缩胶，玻璃板1.0mm 的梳子，待其 40min 凝固后将其浸于电泳缓冲液并拔出梳子；根据 BC所示样品蛋白浓度，取适量待测样品蛋白，以 PBS 调整浓度至相等，与 5×液按 4:1 的体积比混合，95℃变性 5min 后，每孔上样 10μL（50μg），浓缩压 80V，分离胶所加电压 120V，进行恒压电泳。打开电泳仪开关，将电压，待蛋白样品进入分离胶后（出现 Marker 条带），将电压调至 120V。待蓝色底部时，关掉电源，电泳的时间一般为 1h 15min 左右。1.4 转膜准备与凝胶同样大小的 PVDF 膜和滤纸， PVDF 膜预先在甲醇中激活 1min ，然后和滤纸、海绵一起放入转膜液中浸泡 2min。转膜夹芯板正极在下，次放置海绵垫、滤纸、PVDF 膜、凝胶、滤纸、海绵垫，250mA 恒流转膜 1h 451.5 抗原抗体反应

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