来源于芽孢杆菌HJ14耐热酯酶的克隆表达、酶学性质及降解邻苯二甲酸二乙酯研究

发布时间：2020-07-07 22:09

【摘要】：【目的】克隆芽孢杆菌HJ14的酯酶基因Est Z1并利用大肠杆菌表达得到相应的酯酶,分析重组酯酶的酶学性质和对邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate,DEP)的降解。【方法】特异性扩增酯酶基因Est Z1并对其全长测序,分析其氨基酸序列。利用p EASY-E2表达系统将Est Z1转化到Escherichia coli BL21(DE3)中完成异源表达。根据组氨酸标签纯化Est Z1,研究其酶学性质并利用HPLC和LC/MS检测系统定性分析其对DEP的降解。【结果】Est Z1全长903 bp,编码300个氨基酸残基,蛋白分子量33.84 k Da。Est Z1氨基酸序列分析结果显示,与NCBI数据库收录的HSL-like家族酯酶相似度最高可达到98%。酶学性质分析结果显示,Est Z1可水解碳链长度较短的p-NP底物,最适底物为p-NPC4(p-NP butyrate)。Est Z1的最适p H和最适温度分别为9.0和50°C,并且在p H 7.0 9.5和40 70°C范围内保持50%以上的酶活,为耐热碱性酯酶。Est Z1对多数金属离子和化学试剂保有良好的抗性。Est Z1可将DEP水解生成相应的单酯和醇。【结论】本文报道了Bacillus sp.HJ14来源的酯酶基因并对其在大肠杆菌中表达获得的重组酶的酶学性质进行研究,Est Z1具有良好的碱性p H耐受性和热稳定性,能够部分降解DEP,本研究对邻苯二甲酸酯类的生物降解有一定的参考意义。
【图文】：

EstZ1的多序列比对分析Figure2.MultiplesequencealignmentofEstZ1.SequencesretrievedfromtheNCBIserverwerealignedinCLUSTALWandrenderedusingESPriptoutput.Sequencesaregroupedaccordingtosimilarity.EstZ1fromBacillussp.HJ14;3AIKfromFerroplasma;KPN14852fromBacillussp.NH7I_1;AAG09918fromBacilluspumilus;KOO40129fromBacillusokuhidensis;KOS02876fromPaenibacilluspolymyxa;five-pointedstarindicateaminoacidresiduesbelongingtothecatalyt

X-100对EstZ1的活性有部分促进(大约11.1% 46.5%)；Na+，Pb2+，Mn2+，Ni2+，Cu2+，methylalcohol，acetone对EstZ1的活性影响较小(保持在88.0% 105.5%)；Co2+，Hg2+，SDS，β-mercaptoethanol，Tween-80，Ethylalcohol对EstZ1的活性有部分抑制(大约15.3% 78.8%)。其中可破坏二硫键的β-mercaptoethanol对EstZ1有强烈抑制，说明二硫键对于EstZ1的稳定性和活性有较大影响。2.5EstZ1对邻苯二甲酸二乙酯的降解HPLC分析结果显示邻苯二甲酸二乙酯(DEP)标品的保留时间为5.080(图5-A)，产物中除图3.纯化酶EstZ1的SDS-PAGE分析Figure3.PurificationofEstZ1.Lane1:totalproteinsofE.coliBL21(DE3)withblankvectorpEASY-E2;Lane2:totalproteinsofE.coliBL21(DE3)harboringtherecombinantplasmidpEASY-E2-EstZ1;Lane3:purifiedEstZ1;LaneM:proteinmolecularweightmarker.图4.纯化酶EstZ1的酶学特性Figure4.TheenzymaticcharacteristicsofpurifiedEstZ1.A:EffectofpHonEstZ1activity.Reactionswereperformedindifferentbufferswiththeconcentrationof50mmol/Lrangefrom5.0 11.0(McIlvainebufferforpH5.0 8.0,Tris-HClbufferforpH7.0 9.0andBoratebufferforpH9.0 11.0)at37°C,respectively.B:pHstabilityofEstZ1.Theenzymewasincubatedfor1hinbuffersofvariouspHvalues(pH2.0 12.0)at37°C.C:EffectoftemperatureonEstZ1activitywasdeterminedusingp-NPC4assubstrateinthetemperaturerangeof0°Cto95°CinTris-HClbuffer(50mmol/L,pH9.0).D:ThermostabilityofEstZ1.Theenzymewasincubatedfor1hat37°C,60°Cand80°C.1938ZhengPengetal.|ActaMicrobiologicaSinica,2016,56(12)actamicro@im.ac

了在相同的保留时间出现峰还出现了新的峰，表明产物中除了DEP(分子量222)还有新物质生成(图5-B)。酯酶水解邻苯二甲酸酯类的降解途径为酯键逐个水解或者同时水解(图6)，所以DEP的可能降解产物有邻苯二甲酸单乙酯(MEP，分子量194)和邻苯二甲酸(PTH，分子量166)。LC/MS的分析结果显示，可以得到加Na+的分子离子峰m/z为245(图7-A)，减H+的分子离子峰m/z为193(图7-B)，根据分子量推算可以推测出EstZ1水解DEP可生成MEP。表3.金属离子和化学试剂对EstZ1的活力影响Table3.EffectofvariousmetalionsandchemicalagentsonenzymeactivityReagentsConcentrateRelativeactivity/%None0mmol/L100.0±0.4Ag+1mmol/L113.2±0.7Ca2+1mmol/L93.1±0.1K+1mmol/L85.8±0.4Fe2+1mmol/L111.2±0.3Zn2+1mmol/L34.0±0.2Mg2+1mmol/L91.5±0.4Na+1mmol/L103.0±0.2Mn2+1mmol/L93.7±0.3Fe3+1mmol/L146.5±0.0Pb2+1mmol/L88.0±0.1Ni2+1mmol/L103.1±0.9Co2+1mmol/L84.7±0.1Cu2+1mmol/L105.5±0.4Hg2+1mmol/L39.7±0.1Al3+1mmol/L128.3±0.3EDTA1mmol/L125.8±0.2SDS1mmol/L60.4±1.0β-mercaptoethanol1mmol/L21.2±0.1TritonX-1001%V/V111.1±0.1Tween-801%V/V67.1±0.7Methylalcohol1%V/V91.4±0.5Alcohol1%V/V75.1±0.4Acetone1%V/V95.4±0.5图5.HPLC分析结果Figure5.TheresultsofHPLCanalyses.A:DEPstandardsample.B:TheresultsofDEPdegradationafterincubationwithEstZ1.图6.酯酶对邻苯二甲酸酯水解Figure6.DegradationofPAEsbyesterase.彭政等|微生物学报,2016,56(12)1939http://journals.im.ac.cn/actamicrocn

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