基于核酸适配体的睾酮检测方法研究

发布时间：2020-07-08 13:07

【摘要】：睾酮是一种重要的环境内分泌干扰物,外源性睾酮进入哺乳动物生物体内之后能够打破其体内雌雄激素的稳态平衡,从而影响机体正常的生长发育,能够促进疾病甚至癌症的发生。目前,睾酮的检测主要集中于血清与尿液的检查,而在水环境中睾酮的检测研究较少。传统的睾酮检测方法虽然灵敏度较高、精度较好,但需要昂贵的检测仪器以及高素质操作人员,无法在保证精度情况下实现对睾酮的快速检测。本研究基于纳米金聚集的比色法技术,结合核酸适配体技术,开发出三种不同的快速检测水环境睾酮的方法,结论如下:(1)开发了一种基于高浓度盐离子聚集纳米金和睾酮特异性适配体的比色法检测睾酮的技术。高浓度盐离子可以打破分散纳米金颗粒的静电平衡,促使纳米金聚集。在最优检测条件下,检测睾酮的检测限为5.57 nM,检测线性范围为1000~2400 nM,对自来水的加标回收率为99.26~104.29%。(2)开发了一种基于阳离子聚合物聚集纳米金和睾酮特异性适配体的比色法检测睾酮的技术。阳离子聚合物能够与适配体通过静电作用形成复合物,同时也能打破分散纳米颗粒的静电平衡,促使纳米金聚集。在最优检测条件下,该技术检测睾酮的检测限为2.3 nM,线性检测范围为2.27 nM~1.8μM,对自来水的加标回收率为99.81~105.04%。(3)开发了一种基于阳离子表面活性剂聚集纳米金和睾酮特异性适配体的比色法检测睾酮的技术。阳离子表面活性剂能够与适配体形成超分子复合物,同时也能破坏纳米金颗粒间的静电平衡,使其发生聚集。在最优检测条件下,该技术检测睾酮的检测限为1.91 nM,线性检测范围为1.91~800 nM,对自来水的加标回收率为98.94~102.66%。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X832
【图文】：

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图 1-1SELEX 筛选核酸适配体示意图Fig.1-1 Systematic evolution of ligands by exponential enrichment process.3.2 核酸适配体筛选技术而在筛选过程中，筛选的成功与否取决于如何分离靶分子及与其结合的核子。常见的筛选方法主要有基于硝酸纤维膜过滤的 SELEX 技术、基于磁珠与色谱的 SELEX 技术、基于毛细管电泳技术的 SELEX 技术、基于微流控芯片ELEX 技术、Cell-SELEX 技术和其他 SELEX 技术。[1] 基于硝酸纤维膜过滤的 SELEX 技术硝酸纤维素膜经常在蛋白杂交技术 Western blots 和原子力显微镜（atorce microscopy, AFM）被用于固定，因为它基于对氨基酸非特异性结合能够简快速的实现蛋白质固定化。1968 年，Kramlova 团队首次使用硝酸纤维素膜法和快速分离出 RNA 和蛋白质[46]。这种方法已经发展成为一种研究工具，用离固定蛋白质和许多其他组分，然后将该蛋白质可以与其他生物分子反应。ELEX 技术首次被 Gold 团队建立，利用硝酸纤维素膜筛选得到 T4 DNA 聚合

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就不能应用该方法。目前使用较多的是通过相互作用或化学反应来将靶标固定于磁珠上，由于磁珠具有强大的磁性，可以利用磁铁实现快速分离固定了靶标的磁珠（图1-2b,c）。最近，利用磁珠法 SELEX 筛选得到了针对不同靶标的大量核酸适配体[50-52]。该方法的缺点与亲和层析法是类似的，若靶标不能被固定到磁珠表面，该方法不能使用。图 1-2 (a) 亲和色谱法筛选过程原理图 (b) 磁珠法筛选过程图 (c) 几种不同（如磺基和环氧基）功能基团活化磁珠Fig.1-2 (a)A schematic illustration of the selection step from a library using an affinity column (b)The process of the selection step using magnetic beads (c) Several types of functionalgroup-activated beads such as tosyl-activated beads and epoxy-ac

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上海交通大学硕士学位论文[3] 基于毛细管电泳技术的 SELEX 技术毛细管电泳（Capillary electrophoresis, CE）在速度、分辨率、容量和最小样本稀释方面比其他化学分析方法有许多显著的优点。如图 1-3 所示，在电场的作用下，这种方法可以通过电荷、摩擦力和流体力学半径来分离离子形式物质，通过目标、库和目标库复合物之间的迁移率移位不同来筛选获得核酸适配体。特别地是，相比其他技术，CE 技术最大的优点是适配体能够在很少的轮次就能筛选获得，一般2~4 轮。Bowser团队经过仅四轮筛选就获得了神经肽 Y和 IgE 的核酸适配体[53,54]。

【参考文献】