镉对鸡软骨发育及软骨细胞凋亡的影响

发布时间：2020-07-19 01:46

【摘要】：镉(Cadmium,Cd)是环境中一种重金属污染物,对机体有毒性作用。研究显示骨骼作为Cd的主要靶器官之一,长期Cd暴露会导致多种骨骼疾病。软骨细胞的增殖、分化、凋亡在其中发挥重要作用。禽类软骨细胞异常会导致多种骨骼疾病,如肉鸡胫骨软骨发育不良、佝偻病、骨性关节炎、关节退化等,且禽类的软骨生长板有更为丰富的软骨细胞和更深的血管侵入。因此,软骨细胞的分化成熟在骨骼疾病中显得十分重要,然而,目前Cd对鸡软骨发育、软骨细胞增殖分化及凋亡的影响报道较少,所以本研究使用鸡胚软骨以及体外培养的原代鸡软骨细胞为对象,探究Cd对鸡软骨发育及软骨细胞凋亡的影响。1 Cd对鸡胚软骨发育的影响为探究Cd对鸡胚软骨发育的影响,对8日龄鸡胚卵黄囊接种不同浓度Cd(0、0.05、0.1、0.2 mg/mL),处理8 d。石蜡切片和阿尔新蓝-茜素红染色观察软骨生长板发育情况;扫描电镜观察关节软骨表明结构;qRT-PCR检测软骨相关因子Acan、Col2al、Sox9、Coll0al、Mmp-13、Rankl、Opg的表达。结果显示Cd能使生长板软骨细胞分泌的ACAN减少、细胞核固缩溶解;Cd处理组软骨表面胶原纤维变得疏松,排序紊乱。低剂量组(0.05 mg/mL Cd)与对照组相比软骨分化前期相关因子Acan、Sox9、C012al显著升高(P0.05),但软骨分化后期相关转录因子Mmp-13、Col10al表达水平显著(P0.05)或极显著(P0.01)降低,高浓度组均呈抑制作用且呈剂量依赖性。表明低浓度Cd能促进软骨早期分化,但高浓度Cd对软骨生长发育有抑制作用。2 Cd对鸡软骨细胞增殖肥大的影响为探究Cd对鸡软骨细胞增殖肥大的影响,使用不同浓度Cd(0、0.2、2、5、10、20μμM)处理体外培养的原代鸡软骨细胞2、4、6 d,CCK-8检测软骨细胞增殖水平,阿尔新蓝染色鉴定软骨细胞,qRT-PCR检测软骨细胞相关因子Acan Col2al、Coll0a1、Sox9、mp-13、Rankl、Opg的表达。结果显示,0.2 μM Cd处理2 d后软骨细胞分化前期标志性mRNAAcan、Col2a1、Sox9与对照组相比表达量极显著升高(P0.01),随着Cd浓度升高,表达量呈剂量依赖性下降;Cd处理6 d后软骨细胞分化后期标志性mRNA Col10al、Mmp-13与对照组相比表达量均呈显著(P0.05)或极显著(P0.01)下降;2、5、10μMCd处理6d后Rankl、Opg与对照组相比表达量极显著升高(P0.01)。以上结果表明低浓度的Cd可以在早期促进软骨细胞增殖,但随着时间的推移Cd抑制了软骨细胞的分化和成熟,并可影响RANKL/OPG通路。3 Cd对鸡软骨细胞凋亡的影响为了探究Cd对软骨细胞凋亡的影响,本研究采用不同浓度Cd(0、0.2、2、5、10、20 μM)处理体外培养鸡软骨细胞12 h,CCK-8检测软骨细胞活性;AnnexinV-FITC/PI双染法检测软骨细胞凋亡;JC-1检测软骨细胞线粒体膜电位变化;DAPI染色观察细胞核形态学变化;扫描电镜观察软骨细胞表面结构;Westem Blot检测Cleavedcaspase-3表达。结果显示,与对照组相比5μM以上Cd能显著(P0.05)降低软骨细胞活性,促进软骨细胞凋亡,促使细胞表面结构损伤。2 μM以上Cd能显著降(P0.05)低软骨细胞线粒体膜电位水平并且此时细胞核出现皱缩,Cleavedcaspase-3表达水平显著升高(P0.05)。表明Cd能诱导鸡软骨细胞凋亡。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.31;X503.22
【图文】：

生长板内的软骨细胞可以区分为四种不同的细胞层：静止区软骨细胞层、增殖区软骨逡逑细胞层、肥大区软骨细胞层、干骺端细胞钙化沉积层，根据软骨细胞形态的不同，增殖区逡逑软骨细胞又可以分为圆形和柱形软骨细胞（图１－１）。软骨细胞可表达表皮生长因子受体逡逑（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｅｇ斤），但不同阶段的软骨细胞表达不同的基因，在软骨逡逑细胞增殖期，圆形和柱形软骨细胞主要表达甲状旁腺激素相关肽（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ邋Ｈｏｒｍｏｎｅ－逡逑ｒｅｌａｔｅｄＰｅｐｔｉｄｅ，ＰＴＨｒＰ）、转录因子邋Ｓ０Ｘ５邋（＆？５）、Ｓ０Ｘ６邋（？ＳｏＭ）、Ｓ０Ｘ９邋（ＳｏｘＰ）、聚蛋白逡逑多糖（Ａｇｇｒｅｃａｎ，Ａｃａｎ）、ＩＩ邋型胶原酶（ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅｌｌａｌｐｈａｌｃｈａｉｎ，Ｃｏｌ２ａｌ）等，肥大软骨逡逑细胞分泌Ａｃａｎ、Ｃｏｌ２ａｌ、Ｃ型利尿纳肽（Ｃ－ｔｙｐｅ邋ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ邋ｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＮＰ」、转化生长因子逡逑ａ邋（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ－ａ，ｒｇｆ－ｏｔ）、ＩＨＨ邋配体（Ｉｎｄｉａｎ邋Ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ｆＭ）、甲状旁腺激逡逑素受体（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ邋Ｈｏｒｍｏｎｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＰＴＨｌｒ）、转录因子邋Ｒｕｎｘ２逦成纤维细胞生逡逑长因子受体（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ

＼逡逑（ｗｌ．）邋０逦０．０５逦０，１逦０．２邋ｃ＜Ｈｍｖ0ｉＬ＞邋ｔ邋ａ邋ｔ．ｉ图１－３不同浓度Ｃｄ对鸡胚骨骼发育的影响逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｃｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｓｋｅｌｅｔａｌ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ邋ｉｎ邋ｃｈｉｃｋｅｎ邋ｅｍｂｒｙ３．４邋Ｃｄ对关节软骨表面超微结构的影响逡逑扫描电镜观察关节软骨表面超微结构，由图１－４可见对照组关节胶原纤维排列较为致密，０．０５邋ｍｇ／ｍＬＣｄ和０．１邋ｍｇ／ｍＬＣｄ组胶原纤维逐渐变得松散，且排列错ｍｇ／ｍＬ邋Ｃｄ组胶原纤维变得极为松散。逦逡逑

３．５邋Ｃｄ对鸡胚关节软骨标志性ｍＲＮＡ表达的影响逡逑鸡胚卵黄囊接种Ｃｄ邋—周后，利用荧光定量ＰＣＲ检测鸡关节软骨标志性ｍＲＮＡ的表逡逑达变化。结果如图１－５，也伽、的表达量在低浓度Ｃｄ组（０．０５ｍｇ／ｍＬ）有上逡逑升趋势，但Ｊａｗ与ＳｏｘＰ的上升趋势不显著（＿Ｐ＞０．０５），而基因表达显著上升（户＜０．０５）。逡逑随着Ｃｄ浓度的增加，Ｊａｗ、Ｃｏ／２ａ八表达量随之下降，在０．１邋ｍｇ／ｍＬＣｄ组和逡逑０．２邋ｍｇ／ｍＬＣｄ组均呈极显著下降趋势（Ｐ＜０．０１），ｚｉｃａ／ｊ、Ｃｏ／２ａ／在０．２邋ｍｇ／ｍＬＣｄ组极显著逡逑下降（Ｐ＜０．０１）。Ｃｏ／７伽ｉ和表达量随着Ｃｄ浓度的增加呈剂量依赖的下降趋势逡逑（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）邋Ｘｄ组表达下降，０？邋ｌｍｇ／ｍＬＣｄ组与对照组相比差异显著（Ｚ＾Ｏ．ＯＳ），逡逑而的表达量随Ｃｄ浓度上升而上升，呈剂量依赖性，但差异不显著（Ｐ＜０．０５）。逡逑ＡＣ邋ＡＮ逦Ｃ０Ｌ２Ａ１逡逑＿邋２Ｊｈ逦Ｓ０Ｘ９逡逑＿邋１ＪＨ逦１－邋ｊ0逦－ｓ邋１－＊－逡逑Ｉｓ５＊－邋Ｓ邋＾逦ｉｌ１－５－邋Ｂ邋－ｊ－逦Ｐ１°＿邋W逡逑ｉｌｉ邋ｉ－ＭＭＭｍ邋ｒｌｌｉ＾逡逑＾邋Ｈ邋ｌｌ！ｉ｜ｉｌｉ：ｌ邋占。ＪＭ逦Ｍ．陶ｉ邋ｉ°ｃＪｉｐ邋Ｍ邋Ｍ邋ｌｌｌｌｉｉｌ逡逑Ｃｄ（ｍｇ／ｎ，ｌ）邋０逦０．０５逦０．１逦０．２邋ｃｄ（ｍ９／ｍＬ）邋０逦０．０５逦０．１逦Ｃｄ（ｍｇ／ｍｌ）邋０逦０．０５邋Ｏ．ｔ邋０．２逡逑ＭＭＰ－１３逦ＣＯＬ１０Ａ１逡逑１．５－ｊ逦１，Ｓ＊逡逑１邋Ｘ逡逑？邋Ｉｆ邋１．０－邋Ｍ逡逑自ｌ卜■—鑫２逡逑占＇邋Ｊ罪攀

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本文编号：2761720