好氧硝酸盐还原菌Delftia tsuruhatensis NF4的筛

发布时间：2020-07-19 03:52

【摘要】：近年来,污水中排放的含氮物质是导致水体富营养化严重污染的主要因素,引起了人们的广泛关注。氮去除是污水处理过程中的重要环节,传统的硝化-反硝化处理模式,由于其反硝化过程缓慢,需要分离硝化和反硝化反应器,具有成本较高,实现较难的问题。因此近年来,好氧反硝化研究逐渐发展起来,其反硝化过程可以在好氧状态下,将硝酸盐化合物还原成无害的氮气,具有经济有效的生物除氮前景。但目前在实验室条件下对好氧反硝化菌的调查和分离还不足,需要完善补充好氧反硝化微生物资源,为实现好氧硝化-反硝化高效除氮应用奠定重要基础。本文以成都市凤凰河二沟污水处理系统的水体为研究对象,比较了自然状态和实验室好氧条件下,好氧硝化和好氧反硝化细菌的功能多样性;从中筛选了一株具有较强好氧硝酸盐还原能力的代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis NF4),克隆硝酸盐还原酶nap基因并进行原核表达和固定化脱氮功能研究,主要研究结果如下:(1)采用高通量Illumina Miseq测序技术对污水处理生态系统的总进水口,CRI出水口和总出水中的细菌多样性进行研究,并比较了在好氧硝化和好氧反硝化培养基上的培养物与自然水体中细菌多样性的区别。结果共得到509,464条高质量细菌16S rRNA序列,将序列进行分类得到九个细菌门,分别为厚壁菌门(Firmicutes),拟杆菌门(Bacteroidetes),变形菌门(Proteobacteria)等。其中变形菌门(Proteobacteria)是污水处理生态系统的优势类群。人工快渗系统(CRI)出水中变形菌门在自然条件下和在好氧硝化及好氧反硝化培养物中的丰度变化不大。而总进水和总出水样品在好氧硝化和好氧反硝化的培养基中,变形菌门丰度显著下降,拟杆菌门显著增加。基于主坐标分析(PCoA)可知,对于相同采样点水样用好氧硝化和好氧反硝化培养基培养,其两两聚合度均很高。说明利用好氧硝化和好氧反硝化培养基分离到的细菌在很大程度上是重叠的,这类细菌可能同时具有好氧硝化和反硝化功能。CRI的3个样品的聚合度较进水口和出水口样品的聚合度更高,说明人工快渗系统的水样通过好氧硝化,好氧反硝化培养基培养后可以得到与自然水体更为接近的群落组成。(2)基于高通量测序结果,采用平板分离技术对CRI出水口的好氧硝酸盐还原菌进行了分离纯化和鉴定。得到一株好氧硝酸盐还原能力较强的菌株NF4,对硝酸盐去除率为96.8%。染色镜检为革兰氏阴性杆菌,与食酸代尔夫特菌(Delftia]acidovorans)和Delftia tsuruhatensis的生化指标,包括发酵葡萄糖、木糖、乳糖、尿素,双水解精氨酸,还原硝酸盐进行比对发现,与Delftia tsuruhatensis的相似度最高,且三株菌均具有硝酸盐还原能力。16S rDNA分子生物学分析,初步鉴定为代尔夫特菌Delftia tsuruhatensis。该菌原来属于丛毛单胞菌属(Comamonas),随着近年对于该菌的深入进化分支研究,将其单独归入代尔夫特菌属。(3)通过海藻酸钠包埋法,对游离Delftia tsuruhatensis NF4和固定化Delftia tsuruhatensis NF4的反硝化能力进行了比较测定。结果表明,两者对硝酸盐均有去除能力。在33 mg/L的硝态氮初始浓度、接种量5%(V/V)、温度30℃、转速140 r/min、初始pH 7.0的条件下,固定化菌株的硝态氮降解率、亚硝态氮积累量、总氮去除率分别为98.06%、27.46 mg/L、26.17%,为游离态菌株的1.5倍。因此,用海藻酸钠固定化菌株Delftia tsuruhatensis NF4,能够提高菌株反硝化性能。此外对固定化菌株Delftia tsuruhatensis NF4的固定化条件进行了优化,其它条件不变,通过改变培养液中初始硝态氮浓度、初始pH值及培养温度,研究固定化菌株Delftia tsuruhatensis NF4的硝酸盐去除性能的影响,找到最优硝酸盐去除条件。结果表明,固定化Delftia tsuruhatensis NF4在pH值3-9、温度20-45℃、硝态氮初始浓度16.5-165 mg/L均有硝酸盐去除活性。在初始pH 7.0、温度为30℃,硝态氮初始浓度为16.5 mg/L和33 mg/L时,去除率均为100%。硝态氮初始浓度16.5-165 mg/L之间时,24 h时硝酸盐降解活性随着初始浓度的增大而增强。(4)以Delftia tsuruhatensis NF4为出发菌,利用NCBI收录的Delftia tsuruhatensis strain CM13菌的基因组硝酸盐还原酶基因序列(登录号:CP017420.1)为模板,设计nap基因的特异性引物,TA克隆构建重组克隆载体pMD 19-T-nap。利用Nde I/Xho I双酶切和T4连接酶连接构建pET28a(+)-nap重组质粒载体,转化E.coli BL21(DE3)获得BL21(DE3)-pET28a(+)-nap E.colli工程菌并验证。NCBI Blastp蛋白序列比对,表明代尔夫特菌Delftia tsuruhatensis NF4硝酸盐还原酶氨基酸序列与Delftia tsuruhatensis的硝酸盐还原酶(Sequence ID WP_047325778.1)同源性最高,为98.94%,与Delftia acidovorans的硝酸盐还原酶(Sequence ID:WP_034399787.1,Sequence ID:WP_034399787.1)同源性也高于98%。该蛋白属于Molybdopterin-Binding超家族成员。重组子表达的目的蛋白分子量约为101.375 kDa,与预测的蛋白大小相符合。20℃,0.2 mM IPTG条件下诱导的超声破碎上清液表达量比0.4 mM IPTG诱导的略高。结合SDS-PAGE和Western Blot检测结果可知,0.2 mM IPTG诱导主要以包涵体的形式表达,上清表达量低,0.4 mM IPTG诱导的以包涵体的形式表达。通过比较pET28a(+)-nap-BL21工程菌和pET28a(+)-BL21的硝酸盐还原酶活,前者为40.28 U/L,后者为21.62 U/L。表明本实验构建的pET28a(+)-nap-BL21工程菌能够表达具有活性的硝酸盐还原酶。
【学位授予单位】：成都理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;X703;X172
【图文】：

凤凰,污水处理,生态系统,细菌滤器

图 2-1 凤凰河二沟污水处理生态系统水样采集点Figure 2-1 Water Sample Collection Point of Sewage Treatment Ecosystem of FenghuangErgou River.2.2 样品处理取 0.5 mL 凤凰二河沟污水处理生态系统总进水口采集的水样，分别涂布硝化培养基和好氧反硝化培养基，待菌落生长良好，用无菌水洗下菌苔，反洗三次，收集洗液。用一次性细菌滤器（滤膜孔径 0.22 μm）过滤，-80 ℃暂存。总出水口和人工快渗系统（CRI）出水口水样处理方法与之相同，具表 2-1 所示。表 2-1 样品编号和处理方式Table 2-1 Sample Number and Processing Method样品编号处理方式来源IC 细菌滤器原水洗液污水处理生态系统

柱形图,柱形图,样品,微生物多样性

图 2-2 9 个样品的 OTU 和 Tag 数量柱形图Fig. 2-2 OTU and tag quantity cylindrical charts of the nine samples表 2-3 微生物多样性及序列丰度信息Table 2-3 Microbial diversity and sequence abundance样品编号 Clean reads OTU shannon simpson Chao 1 AceIC 46433 171 2.34 0.66 161.45 163.48EC 48924 88 2.16 0.68 85.21 89.71CRIC 54424 131 2.45 0.68 132.55 137.91I.DNF 80100 137 4.57 0.9 139.27 141.877E.DNF 56999 125 4.27 0.9 121 122.36CRI.DNF 64800 103 2.36 0.61 123.9 135.19I.NF 47463 142 4.46 0.88 161 158.931E.NF 50389 132 4.47 0.91 128.25 130.44CRI.NF 59932 118 3.42 0.84 117.81 125.99均值 56607 127.44 3.39 0.78 130.05 133.99

曲线,稀释度,曲线,物种

成都理工大学专业硕士学位论文工快渗系统 CRI 出水口多样性介于两者之间。细菌多样I.NF<CRIC，I.DNF<I.NF<IC，EC<E.DNF<E.NF。硝化培化培养基中的细菌有更高的多样性，但出水口水样的细菌培养基中的细菌多样性低的原因有待进一步研究。曲线（RankAbundance）可以反映样本中物种的丰富度和与物种的丰富度呈正相关，而曲线的平滑程度，反映了样曲线越平缓，物种分布越均匀。从图 2-3（b）中可知，水样在水平方向上范围最大，其物种多样性最高。NF gr DNF group（反硝化培养基组）在垂直方向上，平滑程度培养后，细菌物种的分布更加均匀。

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