基于香豆素和氧杂蒽荧光分子探针的合成及应用

发布时间：2020-08-09 06:01

【摘要】：次氯酸盐(HClO/ClO~-)常被用作实际生活中的漂白剂和消毒剂,但是在使用的过程当中,常会产生各种含氯副产物,如氯气、氯酸盐等,过量的HClO/ClO~-会潜在的危害人体,对生命体内的细胞、组织造成一定程度的损伤。机体的内源性HClO/ClO~-是在细胞里的髓过氧化物酶MPO的催化下由过氧化氢(H_2O_2)与氯离子(Cl~-)作用产生,其对于调节生命体的氧化还原平衡、调控细胞的生命周期及伤口的修复和组织的再生有着重要的作用。目前检测HClO/ClO~-的方法主要有比色法、电化学法及化学发光等方法,但是这些技术均会或多或少的损伤细胞,进而便不利于检测生命系统中的活性物质。氟离子(F~-)和肼(N_2H_4)广泛的应用于实际水体以及工业生产过程中,过量的话则会成为环境污染物质并对环境产生毒害作用,当人体长时间暴露于此便会造成极大程度的损伤,另外F~-作为最小并且电负性最强的阴离子,由于其体积较小,因而检测十分困难。目前检测该种环境污染物的方式主要有色谱法,滴定法,电化学法,Willard-Winter法等,同样的,这些方法不适合于检测生命体系中的物质。近年来,针对特定目标物质的分析检测而设计的一类具有荧光性质的荧光分子探针凭借其较高的灵敏度和选择性、对样品的损伤小甚至可以可视化实时成像的优点在生物化学分析方向逐步发展,这种技术有助于对环境污染物及疾病标志物进行评价、分析和诊断。另外,由探针制备的检测试纸可直观的对环境中污染物进行定性检测,所以整体来说,荧光探针的技术也逐渐的用于实际样品的检测分析中。基于此,制备了三种荧光分子探针用于目标物在实际水样及细胞中的检测,并且制成了便携的检测试纸。本文主要内容如下:(1)香豆素类次氯酸荧光探针的合成和应用基于HClO可裂解出具有很强的亲电作用的Cl~+,因而实验设计了用于特异性识别HClO的荧光探针二甲基硫代氨基甲酸-O-(4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基)酯(DAME),通过核磁图谱及其他手段对探针DAME及反应后产物的结构进行了表征。探针DAME自身无荧光,但与分析物HClO反应后的荧光会明显增强。探针DAME以二甲氨基硫代甲酰氯为受体,亲电的Cl~+会攻击该识别位点,从而释放香豆素的荧光,该探针的激发和发射波长分别位于370 nm和453 nm。探针DAME可以在其他种类活性氧(ROS)的存在下,高选择性地检测HClO。探针DAME检测HClO的线性范围为0-50μmol L~(-1),此时探针的检出限为34.75 nmol L~(-1)。用DAME孵育PC-12细胞,利用显微镜对外加的不同浓度HClO的PC-12细胞进行成像,结果表明探针DAME可用于检测PC-12细胞中外源性不同浓度HClO。此外,探针DAME的试纸被成功用于追踪实际环境样品中HClO的浓度。(2)红光发射的次氯酸根荧光探针由于较长的发射波长的光能渗透深层组织,减少对生物组织的光损伤和自发荧光的干扰,所以在上一项工作的基础上,基于ClO~-的强氧化性,合成了具有长波长发射的荧光探针3-氨基-10-二乙氨基-5-6-二氢苯并[c]黄烷(probe 1)用于在生理条件下特异性检测ClO~-,探针probe 1的激发为570 nm,发射在630 nm处。结果表明探针probe 1在pH 7-8的环境下可对HClO,HClO/ClO~-,ClO~-体系加以区分。ClO~-探针probe 1线性范围0-10μmol L~(-1),检出限2.41 nmol L~(-1)。利用显微镜对探针probe 1孵育的PC-12细胞、脂多糖(LPS)刺激后的PC-12细胞、LPS和4-氨基苯甲酰肼(ABH)处理后的PC-12细胞及外源性不同浓度ClO~-处理后的PC-12细胞进行成像,结果表明探针probe 1可以对PC-12细胞的内、外源性的ClO~-进行成像。实验也制备了检测试纸用于对实际样品的分析。与第一项工作相比,探针probe 1的发射波长、响应时间及检出限都远远低于探针DAME,并且长波长的优点也支撑细胞实验用于对PC-12细胞的内源性物质进行分析。(3)检测氟离子和肼的双功能荧光探针一个探针对多种物质的检测根据文献得知是具有双功能性质的,这种性质为环境物质的检测提供了更为便捷的工具,可以设计一个探针在不同的体系当中对污染物进行定性及定量分析。因此,实验以对硝基苯磺酰氯作为F~-和N_2H_4的识别基团合成了4-硝基苯磺酸4-甲基-2-氧代-2H-色氨酸-7-酯(probe 2)。探针probe 2本身无荧光,但当探针probe 2溶于PBS缓冲液检测N_2H_4时,由于N_2H_4的亲核作用会引起发生亲核芳香取代反应,从而使淬灭基团附近的电子云密度发生变化,致使荧光被释放。当探针probe 2溶于无水乙腈溶剂检测F~-时,利用对硝基苯磺酰氯的去保护作用,从而荧光团的荧光被释放。探针probe 2可以在不同的溶剂体系中高选择性的检测N_2H_4和F~-并且不受其他相关离子及化合物的影响。探针检测F~-检出限为77.82 nmol L~(-1),检测N_2H_4检出限低至29.34nmol L~(-1),这个数值远远低于美国环保署所规定的阈限值。为了开发探针probe 2的实际用途,实验设计了检测试纸用于F~-和气态N_2H_4的定性检测,同时由于探针检测N_2H_4的体系是在PBS缓冲液中,所以probe 2也成功用于活细胞中低浓度N_2H_4的检测,展示了探针生物学方面的应用前景。总体来看,设计的三种荧光分子探针在不断的优化探针的性能,并且均用于对实际样品的分析,红光发射的荧光探针甚至用于对内源性活性物质的检测,因此,通过不断的对探针的发射波长及应用的改进,将对分析物的生物学应用有着更为直观的分析和检测。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X832
【图文】：

质的分析也变得日益重要，因而需要开发一种可以实时进行成像并对比，进而对癌症进行精确的分析。荧光探针择性，用于可视化实时检测成像的技术[1-5]，近年来科学于对环境样品、细胞甚至活体中的物质进行检测分析，从的作用机理。的概述探针的组成为特定的检测物而设计的一类具有荧光性质的分子。通过变化，来判断并确定探针分子是否适合用于该物质的检测如图 1-1 所示）主要是由：（1）荧光团；（2）连接基团，可将二者连接；（3）受体，与待测物相互作用。

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图 1-2）作为一种氧杂蒽类化合计当中。如图 1-3 所示，当罗丹析物作用之后，罗丹明结构上的从无荧光到有荧光，属 turn-on 型于罗丹明类、香豆素类及氟硼吡

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烯分子（TPE）等。罗丹明类[10-12]（如图 1-2）作为一种氧杂蒽类化合物，由于其较为清常被用于探针的设计当中。如图 1-3 所示，当罗丹明的螺内酰胺环处无荧光的，但与分析物作用之后，罗丹明结构上的环会打开，增大母有较强的荧光发射。从无荧光到有荧光，属 turn-on 型的探针，相反则是组近年来主要致力于罗丹明类、香豆素类及氟硼吡咯类物质的设计、图 1-2 罗丹明类物质结构

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