基于特异性酶技术的大肠菌群单管定量快速检测方法研究

发布时间：2020-08-14 08:27

【摘要】：大肠菌群作为评价各种食品、水质和药品的重要微生物指标之一,不仅可用于判断样品是否被粪便污染,还可作为样品被肠道致病菌污染的指示菌,检测大肠菌群具有重要的微生物学意义。目前国内仍以传统的多管发酵法来检测大肠菌群,存在操作步骤繁琐,耗时长等缺点。近年来,基于特异性酶技术的大肠菌群快速检测技术,具有特异性强、灵敏度高、检测快速等优点,得到广泛的认可和应用。虽然基于特异性酶技术的大肠菌群快速检测技术比传统的方法有很大的改进,但到目前为止,检测结果基本都是采用目测定性判断,然后根据MPN法查得样品大肠菌群数量。这种结果判定方法容易出现人为误判,影响实验结果。此外,MPN法所得的结果精确度不高,MPN法的多管测定也增加了检测工作量和试剂的使用量。基于此,本论文研究了一种基于特异性酶技术的大肠菌群单管定量快速检测技术,结合自制的显色培养基及快速检测仪器使用,可以实现单支反应管对大肠菌群进行定量检测。分别选择胰蛋白胨、乳糖、氯化钠作为大肠菌群基础培养基的氮源、碳源和无机盐。通过单因素实验分别验证胰蛋白胨、乳糖、氯化钠的最适添加量和最适p H值,通过正交实验进一步优化最适添加量和最适p H值。研究显色底物邻硝基苯基β-D-半乳糖苷的适宜添加量,确定适宜的显色剂浓度。研究不同种类、不同浓度的抑菌剂对杂菌的抑菌效果,选择合适的抑菌剂及添加量。确定大肠菌群选择性显色培养基的配方如下:胰蛋白胨15.0g/L,乳糖4.5g/L,氯化钠4.5g/L,磷酸氢二钾2.1g/L,磷酸二氢钾1.0g/L,脱氧胆酸钠0.2 g/L,ONPG0.5g/L,p H7.0。通过研究大肠菌群快速检测方法最佳检测波长,温度、p H值对大肠菌群生长及培养液吸光度值的影响,确定最适合大肠菌群生长和水解底物检测的理化条件。通过研究大肠菌群初始接种数量与达到0.2吸光度所需时间的量化关系,建立大肠菌群单管定量快速检测技术。根据建立的大肠菌群单管定量检测技术,选择合适的光源和相关元器件,研制出大肠菌群快速检测仪器。研究结果表明,在410nm检测波长处,当大肠菌群初始接种浓度在7-10~5cfu/m L(g)范围内,大肠菌群初始接种数量与达到0.2吸光度所需时间具有良好的线性关系(R~2=0.995)。当菌浓度为7-10~5cfu/m L(g)时所需检测时间仅为558-275min。将公式y=-0.014x+8.909固化进软件,计算机可根据样品达到0.2吸光度所需要的时间自动计算出大肠菌群的浓度,实现单管定量。研制的大肠菌群单管定量快速检测仪的八个通道间的精密度良好,检测限为每克(毫升)样品中的大肠菌群数不能低于7个。利用大肠菌群单管定量快速检测仪对食品、环境水样进行检测,检测结果与国家标准方法比较,不存在显著性差异(P0.05),相对标准偏差远远低于国家标准方法。大肠菌群单管定量快速检测法具有操作简单,精确性高,数据准确性高,检测时间远小于多管发酵法,单支反应管就可以实现定量,节约试剂等优点,可以代替传统的大肠菌群多管发酵法,具有良好的应用前景。
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TS207.4;X832
【图文】：

大肠菌群,单管,样机,检测时间

只要设制好检测时间，就可自动完成检测。可对检测单位、检测时间、送检单位、检测人员、受检样品信息等进行自定义存储。图3.6 大肠菌群单管定量快速检测仪样机

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40图3.7 大肠菌群单管定量快速检测仪配套软件主机包括 CPU、主板、数据存贮电路、电源板、显示器、显示接口电路、通道控制电路、接口驱动电路，其电路示意图如图 3.8 所示。通道控制电路上有光源稳压控制器，可以为单色光源提供恒定的工作电压，并控制各通道光源开关，解决多通道同时检测时的干扰问题。检测数据由数据存贮电路保存在非易失性数据存贮器中，供显示、查询，通过串行通讯电路，还可以实现实时或打包非实时地与预装《微生物检测系统》处理软件的计算机进行数据交换。检测单元包括固定支架、光源、光学传感器、样品检测管、光源的电源、接口线路板、A/D 信号传输转换器。检测单元含有多个检测通道，每个检测通道均含有独立的固定支架、光源及光学传感器，并配备有样品检测管。单个检测通道示意图如图 3.9 所示。样品检测管可以进行高压蒸汽灭菌

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成数字信号，并传递给主机，从而实现对样品的检测。图3.8 大肠菌群单管定量快速检测仪电路功能图图3.9 大肠菌群单管定量快速检测仪单个检测通道示意图3.3.4.2 大肠菌群单管定量快速检测仪操作方法（1）把大肠菌群单管定量快速检测仪与计算机连接，打开电源。（2）在已经灭过菌的样品检测管中加入无菌的大肠菌群选择性显色培养基，然后加入经过前处理的样品，将检测管放进检测通道中，将整个检测单元放入微生物培养箱中，设置好培养箱的温度。

【参考文献】